基于礦物元素結合化學計量學方法實現煙葉溯源

蘇贊 林濤 胡逸超 程新勝

摘要［目的］通過測定煙葉礦物元素的含量結合化學計量學方法建立關于煙葉溯源的特征指紋圖譜，并對方法的準確性和可靠性進行驗證。［方法］采用電感耦合等離子發射光譜儀結合微波濕法消解分析種植于5個不同地區土壤的25個煙葉樣品中礦物元素的含量，對所得到的元素含量進行單因素方差分析、主成分分析和典型判別分析。［結果］種植于不同地區土壤的煙葉中礦物元素含量存在明顯差異。利用主成分分析得到的前2個主成分能夠充分反映原始數據信息，并且利用對煙葉中礦物元素含量的分析，實現了種植于不同地域土壤中煙葉的產地溯源。結合Fisher判別分析進行驗證并用“留一法”進行交叉檢驗，得到了理想的驗證結果，其正確判別率均達到了100%。［結論］基于煙葉中礦物元素含量的特異性差異可以對煙葉進行正確的溯源分析。

關鍵詞煙草；礦物元素；化學計量學；地理來源；主成分分析；判別分析

中圖分類號TS47? 文獻標識碼A? 文章編號05176611（2024）07019204

doi：10.3969/j.issn.05176611.2024.07.045

Geographical Identification of Tobacco Leaf Based on Inorganic Elements Combine Chemometrics Method

SU Zan1， LIN Tao2， HU Yi-chao1 et al

（1.China Tobacco Guangxi Industrial Co.，Ltd.，Nanning，Guangxi 530001;2.Institute of Advanced Technology， University of Science and Technology of China， Hefei，Anhui 230000）

Abstract［Objective］To establish the characteristic fingerprint of tobacco traceability by the determination of mineral elements in tobacco leaves combined with chemometrics method， and to verify the accuracy and reliability of the method. ［Method］The contents of inorganic elements in 25 tobacco leaf samples planted in soils from five different areas were analyzed by ICP-OES combined with microwave digestion method. The data matrix was sequentially analyzed by one-way-ANOVA， principal component analysis and discriminant analysis. ［Result］There were significant differences among tobacco leaves planted in different soils about the contents of mineral elements. The first two principal components obtained by principal component analysis could approximately reflect the information of original data， and realized the traceability of tobacco planted in soils from different regions by analyzing the mineral elements contents. Fisher discriminant analysis and leave-one-out cross-validation test were performed to validate these results， ideal verification results were obtained， and the correct discrimination rate were 100%， respectively.［Conclusion］Based on the specific differences of inorganic elements could discriminate the geographical origins of tobacco.

Key wordsTobacco;Mineral element;Chemometrics;Geographical origin;Principal component analysis;Discriminant analysis

建立一套高效的煙葉追溯系統不僅能夠防止非法煙葉流入市場、維持煙葉穩定生產，有助于保護煙草種植者的利益，并確保終端卷煙生產企業得到穩定的原料供應。煙葉溯源有助于卷煙企業確定煙葉原料的原產地和特征，并向下游企業和顧客反饋產品質量信息；煙葉供應鏈上的企業在發現煙葉質量、安全性問題時追溯其來源，確定問題所在及形成的原因。

植物源性農產品溯源技術目前在國際上已經得到了快速發展與應用。農產品溯源是基于產自不同地域農產品中的特異性指標，建立指紋圖譜庫進行對不同地區的同類產品進行區分鑒別。如利用礦物元素鑒別植源性農產品來源的理論基礎是這些農產品不能自發地合成這些礦物元素，只能從土壤中獲取這些元素，不同類型土壤的理化性質和有機物質組成有較大的差異，植物礦物元素組成與土壤組成有著直接關系，從而導致其栽培的農作物中化學成分含量有很大差異；與此同時大部分礦物元素的理化性質穩定，短時間內很難自發流失［12］。國際上已經有很多利用農產品中礦物元素的差異結合化學計量學方法對一些農產品（如蜂蜜［3］、水稻［4］、小麥［5］、牛奶［6］、柑橘［7］、大蒜［8］、葡萄酒［9］等）進行溯源鑒別分析的報道。有關煙葉中礦物元素的研究也有很多［1011］，但是關于利用礦物元素對煙葉進行溯源的研究卻鮮見報道。該試驗采用電感耦合等離子體原子發射光譜儀測定煙葉中鋁（Al）、鈣（Ca）、錳（Mn）、鐵（Fe）、鋅（Zn）、鉻（Cr）、鍶（Sr）7種目標礦質元素的含量，結合化學計量學方法對煙葉進行溯源分析，旨在為煙葉產地溯源建立指紋圖譜數據庫模型提供參考。

1材料與方法

1.1試材

硝酸（68%）、高氯酸（70%）、過氧化氫（30%），上海國藥試劑有限公司，所有試劑級別都是優級純；1 000 mg/L的Al、Ca、Mn、Fe、Zn、Cr、Sr單元素標準溶液購買自中國鋼鐵研究院，使用前用超純水稀釋成一系列不同的濃度；生物標準參考物質灌木枝葉組合樣GBW 07603購買于地礦部物化探研究所；超純水（18 MΩ/cm）由MilliQ Element系統制備得到。

1.2儀器

Optima 7300DV 電感耦合等離子體發射光譜儀（ICPOES）購自美國珀金埃爾默儀器公司；電子分析天平（精確度0.000 1 g）購自上海精密科學儀器有限公司；FA1004冷凍干燥機購自上海比朗科技公司；MARS微波消解儀購于美國培安CEM公司；MilliQ超純水儀購自美國Millipore公司。試驗過程中所有的器皿使用前均用10%的稀硝酸浸泡，然后沖洗干凈烘干后再使用。

1.3試驗方法

1.3.1樣品采集。

從安徽蕪湖、廣東韶關、福建三明、云南曲靖和安徽合肥5個地區采集土樣。采樣地點地理信息如表1所示，以上這5個采樣地區（合肥除外）都是我國重要的煙葉種植區域［12］。采樣地點在煙草生產地塊中隨機選取的，取樣方法采用五點取樣法，且采樣土壤的前茬作物均是煙草。取表層土（15～30 cm深）約50 kg并帶回實驗室，在種植煙葉之前，將土壤中的腐根和爛葉去除。將呈塊狀的土壤弄碎，所有土壤準確加入相同比例的煙葉復合肥［13］（N∶P2O5∶K2O=1∶1∶3）（質量比400∶1，土壤∶復合肥），然后分為8份，每份裝入同一大小的口徑約為20 cm的塑料盆缽中待移栽煙葉幼苗。

煙苗（云煙97）是取自安徽省煙草公司皖南煙葉公司，選取長勢一致的煙苗，移栽到裝有不同地區土壤的塑料盆缽中，每隔3 d澆灌一次清水，初花期打頂，每株保留16片葉，待中部葉成熟后，一次性采集中部8片葉（下面去4片、頂部去4片），每種土壤處理選取5株長勢相同的煙株，將各單株葉片采收后懸于室內避光處晾制，晾制前用毛刷去除煙葉表面粉塵與雜物。30 d后將各單株葉片烘干，干燥后用研缽粉碎，過100目（150 μm）篩，然后用塑料密封袋密封并標記冷藏保存，待進一步分析。

分別收集5份土壤樣品在70 ℃的恒溫干燥箱內烘干過夜，用研缽研碎并過100目篩，然后用塑料密封袋密封并標記冷藏保存，待進一步分析。

1.3.2樣品制備。

準確稱量均質化的煙葉粉末0.5 g（精確到0.000 1 g）并轉移至聚四氟乙烯（PFA）消解罐中，加入4 mL濃HNO3、1 mL HClO4和1 mL H2O2后靜置過夜，第2天再加入2 mL硝酸，然后裝入消解罐內再放入微波消解儀內，并按照表2所示的升溫程序進行消解［1011］。消解完畢待溫度降至低于40 ℃后取出消解罐，將消解后的澄清溶液轉移至聚對苯二甲酸類塑料（PETP）容量瓶中，用超純水洗滌PFA消解罐3次，洗滌液也轉移至容量瓶中，用超純水定容至100 mL。采用上述相同的方法消解3個灌木枝葉標準品，并制備一組溶劑空白溶液。

1.3.3無機元素測定。

由于ICPOES具有優良的重現性和精確度，常用來測定動植物組織中礦物元素的含量［2，813］。該試驗采用ICPOES對煙葉中目標礦物元素進行測定，結合前人的檢測方法［1417］，此次試驗中所選的波長如表3所示。

1.4數據分析

對煙葉中的所有原始數據統一濃度（平均值±方差，mg/kg）表示。為消除不同元素之間的差異性，在進行數據分析之前對所有原始數據進行標準化。利用單因素方差分析比較分析不同土壤種植的煙葉樣品中礦物元素的差異，利用主成分分析將25個煙葉樣品進行聚類分析，再利用Fisher函數典型判別分析評估驗證主成分分析聚類方法對煙葉種植土壤來源的判別的可行性和準確性［18］。主成分分析和典型判別分析都是通過降維的思想，在原始信息大部分被保留的前提下，將多個變量轉化為幾個綜合變量的多元統計分析方法［1820］。不同于主成分分析，典型判別分析是有管理模式的模式識別方法，也就是說主成分分析是無監督式學習而典型判別分析是監督式學習［1820］?！傲粢环ā苯徊骝炞C的原理是每個樣品數據都是按照從該數據矩陣以外的所有其他數據集派生的函數來進行分類［19］。以上所有數據分析都是利用IBM SPSS 19.0和MATLAB 2010來實現。

2結果與分析

2.1礦物元素分析方法準確度檢驗

為了考察所選用的微波消解結合ICPOES檢測方法測定煙葉中礦物元素含量的準確性和可靠性，試驗過程中平行測定了國家一級標準物質灌木枝葉（GBW 07603）［2122］，測定的值均在參考值范圍內（表3），表明該方法適用于植物組織的礦物元素含量的測定?；厥章实臏y定方法是隨機挑選一個已測煙葉樣品，然后加入一定濃度的標準樣品，再次檢測濃度，回收率在89.7%～106.2%，說明穩定性良好。參照BrzezichaCirocka等［23］的方法，將空白溶液平均值加上3倍標準偏差定義為檢出限（LOD），由表3可知，7種礦質元素的檢出限為0.010～0.538 μg/g。

2.2煙葉中礦物元素的含量

分別對種植在5個不同地區土壤的煙葉中礦物元素含量進行檢測并進行方差分析，結果發現（表4），種植在不同地區土壤上的煙葉中所有目標元素（Al、Ca、Mn、Fe、Zn、Cr、Sr）間均存在明顯差異，說明土壤對煙葉中礦物元素含量的影響明顯。煙葉中礦物元素含量從大到小依次是Ca>Fe>Al>Mn>Sr>Zn>Cr。

2.3主成分分析

利用上述7個元素作為分析參數因子，對5個地區的煙葉樣品進行產地主成分分析。通過主成分分析，得到6個有效主成分，選取第1、第2主成分進行得分分析。第1主成分貢獻率為46.109%，第2主成分貢獻率為28.623%，前2個主成分的累計貢獻率達到了74.732%，達到可充分反映原始數據信息的要求［24］。此外，基于這些元素進行主成分分析的KaiserMeyerOlkin（KMO）檢測結果是0.517，巴特利特球形檢驗的結果為df=21，P<0.001，表明使用7個元素的濃度數值作為參數指標進行主成分分析是可行的［25］。各主成分荷載表達式（F1、F2）如下所示：

F1=0.359Al0.469Ca+0.456Mn+0.280Fe+0.061Zn+0.358Cr0.481Sr

F2=0.062Al0.337Ca+0.334Mn0.571Fe+0.607Zn0.152Cr+0.230Sr

以第1、第2主成分作為坐標系，將25個煙葉樣品進行聚類分析的得分圖如圖1所示。第1、第2主成分可以將25個煙葉樣品完全正確區分，判別準確率達到100%。

2.4典型判別分析為了驗證主成分分析的分類結果，對7個元素含量的數據矩陣進行Fisher典型判別分析，典型判別分析函數系數表達式如下：

函數1=0.765Al0.197Ca+0.553Mn+1.892Fe0.120Zn0.035Cr2.188Sr

函數2=0.292Al0.341Ca+0.788Mn0.878Fe+0.578Zn0.177Cr+0.915Sr

從圖2和表5可以看出，利用判別分析能夠將25個煙葉樣品完全區分，準確率達到了100%，采用“留一法”對數據進行交叉驗證，交叉驗證的準確率也是100%。

3結論

該研究采用電感耦合等離子發射光譜儀結合微波濕法消解分析了種植于5個不同地區土壤的25個煙葉樣品中礦物元素的含量，對所得到的元素含量進行單因素方差分析、主成分分析和典型判別分析。結果發現種植于不同地區土壤的煙葉中礦物元素含量存在明顯差異，表明植物體內的生物元素組成與土壤密切相關。利用主成分分析得到的前2個主成分能夠充分反映原始數據信息，并且利用對煙葉中礦物元素含量的分析，實現了種植于不同地域土壤中煙葉的產地溯源。將礦物元素作為因素進行Fisher函數典型判別分析在小范圍內區分煙葉植株的來源，其初始正確率達到了100%，用“留一法”進行交叉驗證檢驗的正確識別率同樣達到100%，說明可以通過煙葉中的礦物元素含量差異對煙葉進行溯源。建立基于礦物元素結合化學計量學方法可以為煙葉生產和進出口質量控制建立指紋圖譜數據庫模型提供參考依據，可以對煙葉進行快速溯源鑒別。此外，對于今后煙葉種植過程中應根據不同地域的背景差異從有機肥料和特殊比例復合肥料等方面進行深入研究。

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基金項目廣西中煙工業有限責任公司資助項目（2021450000340033）。

作者簡介蘇贊（1980—），男，廣西梧州人，農藝師，從事煙葉原料質量研究。

通信作者，農藝師，碩士，從事植物病理和生物技術研究。