向日葵HaFATA基因的生物信息學和表達分析

摘要? FATA編碼脂酰-?；d體蛋白硫酯酶A，將質體中以脂酰-ACP形式存在的脂肪酸水解成游離的脂酰-CoA和?；d體蛋白。為了解向日葵HaFATA基因編碼蛋白的結構、功能及基因表達特性，對HaFATA編碼蛋白進行生物信息學和基因表達分析。預測HaFATA為堿性且為親水性蛋白，二級結構主要是無規則卷曲，預測亞細胞定位于葉綠體。系統進化分析表明，HaFATA與同屬菊科的萵苣（Lactuca sativa L.）和水飛薊（Silybum marianum L.）FATA進化關系近，序列相似性分別為90%、87%。HaFATA表達分析結果顯示，HaFATA在向日葵種子中表達最高，其次為在管狀花和葉中，在莖、舌狀花和根中不表達，在發育的種子中，HaFATA除在開花后12 d表達相對較低，在其他6個發育時期表達均較高，表明其對于種子發育和油脂積累可能具有重要作用。

關鍵詞? 向日葵；脂酰-?；d體蛋白硫酯酶；脂肪酸；生物信息學；表達分析

中圖分類號? S565.5?? 文獻標識碼? A?? 文章編號? 0517-6611（2024）07-0096-03

doi： 10.3969/j.issn.0517-6611.2024.07.024

Bioinformatics and Expression Analysis of HaFATA Gene in Sunflower

ZHOU Fei1，2

（1.Industrial Crops Institute，Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Harbin，Heilongjiang 150086;2.Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences Postdoctoral Programme，Harbin，Heilongjiang 150086）

Abstract? FATA encodes lipoacylacyl carrier protein thioesterase A，which hydrolyzes fatty acids in the form of lipoacylACP into free lipoacylCoA and acyl carrier protein in plastids.In order to understand the structure and function of the protein encoded by HaFATA gene and gene expression characteristics in sunflower，the bioinformatics of the protein encoded by HafabZ and gene expression were analyzed.It was predicted that the protein encoded by HaFATA was basic and hydrophilic.The secondary structure of the protein encoded by HaFATA was mainly irregular coil，and the subcellular localization was predicted in the chloroplast.Phylogenetic analysis showed that HaFATA was closely related to Lactuca sativa L.and Silybum marianum L.，which belong to the same family of compositae，with sequence similarity of 90% and 87%，respectively.The results of expression analysis of HaFATA showed that HaFATA expression was the highest in sunflower seeds，followed by tubular flowers and leaves，and was not expressed in stems，ligulate flowers and roots.In developing seeds，HaFATA expression was relatively low at 12 d after flowering，and was high at the other six development stages，indicating that it might play an important role in seed development and oil accumulation.

Key words? Sunflower;Lipoacylacyl carrier protein thioesterase;Fatty acid;Bioinformatics;Expression analysis

向日葵（Helianthus annuus L.）是世界上重要的油料作物之一，向日葵油中富含不飽和脂肪酸，是營養價值很高的食用油。植物種子油合成和脂肪酸積累由甘油三酯和脂肪酸生物合成代謝通路上的基因調控。脂酰-?；d體蛋白硫酯酶（fatty acyl acyl carrier protien thioesterase，FAT）將質體中以脂酰-ACP形式存在的脂肪酸水解成游離的脂酰-CoA和?；d體蛋白（ACP），進而終止脂肪酸碳鏈延長。根據其氨基酸序列和底物偏好性分為FATA和FATB 2個亞家族，FATA偏好不飽和?；?ACP，尤其對18：1-ACP活性最高，相反，FATB通常對飽和?；?ACP顯示出高活性［1］。FAT基因在脂肪酸合成代謝過程中對脂肪酸含量和組成具有重要的調控作用［2］。

目前，盡管已經從向日葵中克隆了FATA基因［3］，但是關于該基因研究報道較少。筆者通過分析前期獲得的高油酸向日葵種子發育不同時期的轉錄組數據［4］，在脂肪酸生物合成代謝通路中鑒定出顯著差異表達的HaFATA基因，對該基因編碼蛋白進行生物信息學分析，并對其在高油酸向日葵不同發育時期的種子以及其他組織部位的表達模式進行分析，以期為今后該基因功能的研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料

向日葵高油酸保持系“L-1-OL-1”于2019年種植于黑龍江省農業科學院經濟作物研究所試驗基地（呼蘭區康金鎮）。根據開花后不同天數于同一時間段對種子取樣，從開花7 d起，每5 d取樣1次，取至開花后37 d，每次取花盤最外3圈的種子，同時取向日葵開花后7 d的根、莖、葉、管狀花、舌狀花，將材料液氮速凍后凍存于-80 ℃冰箱，用于實時熒光定量PCR分析。

1.2 方法

1.2.1??? 基因的生物信息學分析。

在NCBI的BLAST數據庫中進行序列同源性比對和相似性搜索；利用ExPASy系統下的蛋白質基本理化性質預測工具Protparam（https：//web.expasy.org/protparam/）預測氨基酸組成、相對分子量、等電點和原子組成等參數；利用MEGA7軟件構建系統進化樹；利用SOPMA在線程序（https：//npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）分析蛋白的二級結構；利用Protscale在線軟件（http：//web.expasy.org/protscale/）分析氨基酸序列的親/疏水性；利用Cell-PLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）在線軟件預測基因的亞細胞定位。

1.2.2??? 熒光定量PCR分析。

利用植物總RNA提取試劑盒（天根）對向日葵種子總RNA進行提取，取0.5 μg RNA利用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover（TOYOBO）合成cDNA第1條鏈。采用THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix（TOYOBO）試劑，Roche LightCycler 480II熒光定量PCR儀，以向日葵β-actin基因（AF282624）為內參基因，Real-Time PCR總反應體系為20 μL：cDNA 1.2 μL，SYBR Green 10.0 μL，Primer 0.6 μL，ddH2O 7.6 μL。Real-Time PCR反應程序：98 ℃ 2 min，98 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，68 ℃ 30 s，共45個循環，待PCR反應結束后進行溶解曲線分析，采用2-ΔΔCt法進行目標基因的表達量分析。內參基因β-actin引物為F：GCAAAAAGCAGCTCGTCTGT，R：AGCAGCTTCCATTCCAATCA，HaFATA熒光定量引物為F：GTGTCGGATTTTCAACGGATG，R：TCAACCACATCACTCCAAGC。

2 結果與分析

2.1 HaFATA生物信息學分析

2.1.1??? 蛋白質基本理化性質預測。

HaFATA基因包含有1 098 bp 的開放閱讀框，編碼365個氨基酸。蛋白質基本理化性質預測表明：HaFATA基因編碼蛋白的原子總數為5 786個，分子式為C1788H2893N533O557S15，蛋白分子量41.25 kD，等電點理論值8.40，預測該蛋白是堿性蛋白。HaFATA編碼蛋白氨基酸組成見表1。

2.1.2??? 蛋白質二級結構預測。

預測分析HaFATA編碼蛋白質的二級結構，結果顯示：該蛋白質有36.99%的α螺旋，3836%的無規則卷曲，20.00%的延伸鏈，4.66%的β轉角。預測結果表明，HaFATA編碼蛋白質的二級結構為無規則卷曲（圖1）。

2.1.3??? 蛋白質親疏水性分析和亞細胞定位預測。

對HaFATA編碼蛋白質的氨基酸序列進行親疏水性分析。大于0部分多于50％為疏水性蛋白，而小于0部分多于50％為親水性蛋白，結果表明：HaFATA編碼蛋白為親水性蛋白（圖2）。Cell-PLoc 2.0軟件預測HaFATA編碼蛋白亞細胞定位于葉綠體。

2.1.4??? HaFATA基因系統進化分析。

將向日葵HaFATA和同為FAT家族的FatB基因與玉米（Zea mays L.）、亞麻芥（Camelina sativa L.）等物種FATA以及擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）和甘藍型油菜（Brassica napus L.）FATA、FATB的氨基酸序列進行了系統進化樹構建（圖3），結果發現：向日葵HaFATA與其他物種的FATA聚在一個大分支上，與同屬菊科的萵苣（Lactuca sativa L.）和水飛薊（Silybum marianum L.）FATA進化關系最近，序列相似性分別為90%、87%。

2.2 HaFATA基因表達分析

通過qRT-PCR發現，HaFATA（脂肪?；鵄CP硫酯酶A）在向日葵種子中表達最高，其次是管狀花和葉，在莖、舌狀花、根中幾乎不表達。在種子發育過程中，HaFATA除在開花后12 d種子中表達相對較低，在其他6個發育時期表達均較高，其中在開花后27 d種子中達最高（圖4）。

3 討論

在植物中發現的不同FAT基因家族中，FATA在C18飽和與不飽和脂肪酸的輸出中起著重要作用［5］。根據紅花FATA的cDNA序列克隆得到蕪荽FATA基因并將其在大腸桿菌表達，結果表明CsFATA對C18：1-ACP的特異性最高［6］。當山竹FATA在體外表達時，發現其對C18：1-ACP的特異性最強，其次是C18：0-ACP，再次是C16：0-ACP［7］。從向日葵中克隆出FATA基因，純化并鑒定其編碼酶，發現向日葵HaFatA1 cDNA編碼一個功能性硫酯酶，偏好單不飽和?；?ACPs［3］。

FATA對植物油脂合成中脂肪酸的含量和組成起關鍵作用。目前，已從多種植物中純化出FAT，擬南芥基因組含有2個拷貝的FatA基因（At3g25110 和 At4g13050），這2個硫酯酶亞型表達相似且幾乎在所有組織表達［8］。擬南芥fata2突變體干種子中除C24：0略有下降和C22：0水平不變外，所有其他脂肪酸增加10%～60%［9］。敲除擬南芥FATA基因2個拷貝的雙突變體植株，種子的三酰甘油（TAG）含量降低，脂肪酸組分發生了變化，亞麻酸和芥酸占脂肪酸的百分比提高［5］。甘藍型油菜中3個FATA基因BnaA.FATA.a、 BnaC.FATA.b、 BnaA.FATA.c轉化到擬南芥中，轉基因株系中的飽和脂肪酸含量顯著降低，而不飽和脂肪酸含量均顯著增加［10］。將麻瘋樹JcFATA基因干涉表達載體轉入野生型擬南芥后，與野生擬南芥相比，其脂肪酸含量都有所降低［11］。該研究發現，向日葵HaFATA基因在向日葵種子整個發育過程中表達量較高，這與前人研究結果一致［12］，表明其對于種子發育和油脂積累可能具有重要作用，但具體基因功能還需進一步驗證。

參考文獻

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基金項目?? 黑龍江省省屬科研院所科研業務費項目（CZKYF2022-1-C037）；財政部和農業農村部：國家現代農業產業技術體系（CARS-14）。

作者簡介?? 周菲（1984—），女，遼寧丹東人，助理研究員，博士，從事向日葵遺傳育種研究。