基于動物模型探討中西醫治療黃褐斑的作用機制*

王雪蓉,張思琪,朱少炳,張淼

1.黑龍江中醫藥大學,黑龍江 哈爾濱 150040; 2.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院,黑龍江 哈爾濱 150040

黃褐斑(chloasma)是一種常見的后天獲得性黑色素沉著類疾病,以日曬部位為主,好發于面部,較少見于頸部和前臂,一般以深褐色點狀斑塊為特點,呈對稱性分布于兩側顴部及頰部,可發生于所有種族和人群中,發病率為1%～50%[1],且深色皮膚類型及中青年女性在該病中尤為突出[2]。本病雖無不適,但因其多發生于面部,對女性患者的外貌、心理及社交活動有著不可小覷的影響[3]。日前,黃褐斑的發病機制尚未明確,傳統醫學認為其與五臟中的肝脾腎密切相關,提出了“疏肝健脾補腎”的治療原則[4]。而現代醫學則認為遺傳、日光、激素水平為主要致病因素,并提出“減少色素生成、血管的增生、恢復皮膚屏障”的指導原則[5]。目前,尚未明確其發病因素,且臨床療效均有波動,因此確定其發病機制、研發出高效穩定的祛斑藥物已成為皮膚科學術領域的熱門研究。黃褐斑動物模型作為探索該病的重要方式,對于發現其病理機制尤為重要。因此,本文主要綜述了近年來中西醫對此動物模型的機制研究,并在諸多的治療方式中,總結更佳治療模式,以期為今后的臨床研究提供新的理論基礎。

1 黃褐斑動物模型制備

理想的黃褐斑造模動物主要有兩方面的基本要求,其一是與人類的生理病理機制類似,其二是與人類黃褐斑發病機理相似,且相關癥狀能夠被人類所使用的治療藥物改善[6]。

1.1 物種及品系的選取歸其根源,黃褐斑的發生為黑色素的過度生成,而黑色素由黑色素細胞產生[7],因此建立含有豐富的黑色素細胞的動物對復制黃褐斑的發病過程至關重要。在中國知網上以“黃褐斑動物模型”為檢索詞,發現近10年內,制備黃褐斑動物模型最常選用的動物為小鼠、大鼠、豚鼠。不同品系的鼠有其獨具特色的表型,目前常用的小鼠包括昆明小鼠[8-9]、小白鼠[10]、Balb/c小鼠[11]、C57BL/6小鼠[12]等,豚鼠常用棕背色[13-15]或白色豚鼠[16-17],大鼠一般則選用SD大鼠[18-19]。不過,在以上品系中運用最廣泛的是棕背色豚鼠,其次是昆明小鼠,最后為白色豚鼠或SD大鼠,前兩種均可發生色素沉著,其中前者在體型上較大,皮膚中所含的黑色素細胞數量及分布情況與人體極其相似,相比前者而言,后者體型較小,且黑色素細胞多分布于耳部,因此在科研實驗中常選用耳部皮膚對其檢測[20],兩者對比,前者在皮膚利用度上具有明顯優勢;而后兩種均屬白化病鼠,黑色素細胞活躍狀態差,故在科研應用上與前兩種相比稍顯遜色。

1.2 造模方法現有文獻研究表明,黃褐斑動物模型制備方法尚未形成統一標準,主要是通過疾病的發病因素進行模擬以誘導皮膚發生色素沉著。目前,常用的造模方法有紫外線照射、黃體酮注射及二者聯合造模3種。其中,紫外線照射是最為常用的造模方式,也是促進黑色素生成的外源性刺激之一,尤其是波長在280～320 nm的中波紫外線[21]。通過每日不同劑量或時長的照射使得皮膚色素沉積顏色趨于穩定,由于各位學者在選用燈具及照射劑量上均有所不同,因此照射強度便是影響造模效果的主要因素。而黃體酮注射造模原理主要為刺激雌激素水平,促使黑色素細胞增多,以誘發色素沉著[22]。多數學者均采用每日按20 mg·kg-1注射于不同種屬的動物模型的后腿根部,左右腿隔日交替[9,18,23]。但有研究發現,不同種屬間有所差異,因此該建模方式可能存在不穩定性[20]。相比前者而言,此方式能依據體重精準計算出注射劑量。最后,紫外線照射聯合黃體酮注射造模是病因與癥狀的雙重結合,不僅滿足了引發黃褐斑發病的兩大臨床特點:陽光照射及激素水平,在模型呈現上亦最大化地達到了此病的病理表現。

如上3種方法在實際運用的過程各有利弊,但在造模周期上絕大部分多為30 d,期間并進行表觀評分及病理學檢測,以驗證模型是否成功[17,24-26]。

2 治療手段及作用機制

在治療黃褐斑動物模型的過程中,中西醫運用不同的治療方式驗證其療效,探究其治療機理,治療機制主要涉及抑制黑色素的合成、抗氧化、調節激素水平等方面。

2.1 抑制黑色素合成黑色素對人體的膚色有著重要的影響,大部分在表皮基底層分布[27]。盡管在保護皮膚免受紫外線傷害方面起著不可或缺的作用,但其過度的分裂增殖及細胞數目增長均是導致黃褐斑產生的重要原因之一[28]。同時,在黑色素生成的這一過程中與2個蛋白密切相關;包括小眼畸形相關轉錄因子(microphthalmia-associated transcription factor,MITF)及酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)。其中,MITF是調節黑色素生成的關鍵因素,而TYR是黑色素生成的核心調節酶,其活性大小決定著黑色素合成的數量,并遍及人體及動植物之中。同時MITF可調控TYR家族的表達,參與黑色素的生成[29]。因此,抑制黑色素合成在治療黃褐斑的過程中為首要任務。

2.1.1 中醫方面研究發現,運用桃紅四物湯對黃褐斑模型小鼠干預后,對其進行皮膚及血液檢測,TYR含量及黑色素細胞數量明顯低于對照組,且高劑量優于低劑量[23],可知桃紅四物湯可能通過調控TYR含量并抑制黑色素細胞防治黃褐斑。而以白僵蠶、白及、白蘞、白附子等為主要成分的“玉容面膜”治療組與其他各組相比,不僅黃褐斑動物模型的黑色素顆粒明顯減少,不良反應亦優于外用氫醌乳膏的對照組[30],可能與其中藥藥理成分相關。此外,有研究顯示在治療頻次及周期相同的情況下,電針黃褐斑SD大鼠三陰交穴與外涂VC組及模型組相比,能夠更有效地改善色素沉著,且在檢測皮膚中TYR的水平時,電針組明顯優于其他組別[19],可見針刺干預可降低皮膚中TYR的含量及活性,抑制皮膚中黑色素的合成。

2.1.2 西醫方面有學者發現,使用熊果苷聯合氨甲環酸(tranexamic acid,TXA)注射治療昆明種黃褐斑小鼠,檢測各組皮膚中干細胞因子(stem cell factord,SCF)、C-kit蛋白表達及TYR水平,發現聯合治療組表達量低于其他組別,可能是由于熊果苷能夠抑制TYR的活性以減少黑色素的生成[31]。此外,TXA也與TYR密切相關,為治療黃褐斑的首選藥物[32],兩者聯用治療該病效果更佳。此外,有研究選用調q激光作為實驗組治療經中波紫外線誘導的黃褐斑小鼠,與模型組及氫醌霜對照組相比,皮膚改善明顯,且病理檢測中黑色素細胞及顆粒也大幅下降[33]。由此推斷,調q激光治療黃褐斑的機制可能與其干擾黑色素生成有關。另有研究顯示,以超脈沖點陣CO2激光聯合外用TXA治療黃褐斑豚鼠,觀測治療前后皮損區發現,聯合組相比于其他治療組,皮膚色素情況及黑素顆粒含量均明顯改善[34]。由于超脈沖點陣CO2激光是以局部光熱為作用機理,能夠刺激角質形成細胞(keratinocyte,KC)并促進表皮黑素的排出,而TXA在結構上與酪氨酸(tyrosine,Tyr)相似并能抑制其與酶的結合,以達到減少色素沉著的目的[32],兩者聯用除發揮各自的優勢外,也促進了TXA注射液的透皮性。

綜上,相比單一的治療手段而言,聯合治療優勢更為突出,在探討其中的作用機制時更傾向選擇對TYR的影響,進一步抑制黑色素的合成以治療黃褐斑。

2.2 抗氧化氧化與抗氧化之間的平衡失調,是黃褐斑公認的主要誘因[35]。正常情況下,體內有許多氧自由基清除劑,如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)等,當自由基水平過高時,在氧自由基清除劑的調控下體內處于氧化與抗氧化間的協調平衡狀態[36]。同時,氧自由基生成過多可造成生物膜的脂質過氧化,從而分解產生具有強氧化作用的丙二醛(malondialdehyde,MDA),使蛋白質分子發生交聯形成色素[37]。推理抗氧化可能是黃褐斑治療的重要機制之一,且SOD、MDA與氧化及抗氧化相關。

2.2.1 中醫方面研究發現,以丹參、當歸、白附子等養血化瘀消斑中藥為主的“美膚散”治療組,對黃褐斑昆明小鼠療效明顯,同時檢測各組皮膚及肝臟組織中的SOD活性及MDA含量,發現美膚散組不僅能明顯降低組織中MDA的含量,也能升高SOD的活性[9],推測與其藥理成分密不可分,可在加強機體抗氧化能力的同時,減少色素的合成。此外,有學者采用白芷、白及、白蘞、白鮮皮、白茯苓研制而成的“五白散”凝膠與其傳統散貼劑分別外敷于黃褐斑豚鼠治療30 d后,通過皮膚病理檢測發現,前者陽性細胞比率、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)活力及MDA含量等指標均優于后者[38],可見改良后的外用凝膠治療黃褐斑豚鼠的作用機理與抗氧化及減少黑色素顆粒相關。另外,研究發現,以中波紫外線聯合黃體酮誘導黃褐斑昆明小鼠,經針刺血海、曲池、陽陵泉治療10 d后,皮膚基底層內黑色素數量與模型組相比明顯減少,同時對比治療前后肝、腦組織中的SOD及MDA的水平,相比模型組,針刺組整體差異顯著[39]。由此推測,以上三穴不僅能起到歸經的針刺效果,還能增強各臟腑的抗氧化能力從而達到治療黃褐斑的目的。而在最新的研究中發現,選用枸杞子、芝麻、核桃、碧螺春等組成的枸杞復方顆粒制劑治療ICR雌性黃褐斑小鼠,經取材檢測發現,小鼠局部皮膚暗沉及黑色素細胞數量較模型組明顯改善,且在檢測T-SOD、MDA、TYR指標時發現,與其他組相比,中藥組中第一項指標水平有所提升,而二、三項指標水平均有所下降[40],推測該組之所以能夠改善模型小鼠的皮膚情況,與增強肌膚的抗氧化能力及減少黑色素合成密不可分。

2.2.2 西醫方面研究發現,利用低強度及低頻率的超聲輻照配合氫醌對SD 黃褐斑大鼠進行14 d連續治療后,各項取材樣本經SOD及MDA檢測后,和其他各組相比,差異顯著[41],主要是由于氫醌能使TYR的活性受到抑制且對黑色素也有一定的影響[42]。另外,低頻超聲能促進藥物的滲透性,可見兩者聯用能充分發揮各自優勢以治療黃褐斑。此外,有學者在運用熊果苷治療黃褐斑豚鼠30 d后,經皮膚檢測發現,治療組不僅能抑制Tyr活性,對SOD及MDA的水平也有所影響[28],推測其作用機理與抑制黑色素的Tyr活性密不可分,可通過提升皮膚抗氧化反應治療黃褐斑。此外,有研究利用獼猴桃籽油治療經黃體酮注射造模而成的黃褐斑小鼠30 d后,檢測其皮膚及肝臟SOD、MDA含量發現,該組SOD、MDA水平明顯優于氫醌對照組,主要是由于獼猴桃籽中富含大量α-亞麻酸、亞油酸等,能有效抑制黑色素合成的物質,分析該方式治療黃褐斑的作用機制也與抗氧化相關。

綜上,中西醫治療黃褐斑抗氧化的機制研究主要是通過SOD、MDA水平進行衡量,這兩項指標也為驗證黃褐斑動物模型提供了重要參考。

2.3 調節雌激素水平雌激素主要由黃體及卵泡產生,不僅有促進和維持生殖器官和第二性征的生理作用,對內分泌、代謝系統、皮膚等亦有明顯的影響[43]。黃褐斑在臨床中多發于荷爾蒙活動盛行時期,如妊娠、口服避孕藥等,而E2常作為其評定指標,由此推理雌激素可能是該病發生的另一誘因。

2.3.1 中醫方面有學者選用以山藥、當歸、山茱萸等滋養消斑藥物為主要成分的“四六湯”作為治療組,在治療經黃體酮注射聯合中波紫外線造模而成的黃褐斑豚鼠模型4周后,檢測各組SOD、MDA、E2水平發現,治療組相比于維生素C治療的陽性對照組更有優勢[44]。由此得知“四六湯”對黃褐斑動物模型的作用機理除提高其抗氧化能力以外,又能改善其機體內的激素水平。另外有研究選用電針阿是穴及三陰交穴每日20 min,對中波紫外線誘導而致的黃褐斑大鼠模型治療30 d后,檢測發現該組皮膚中E2及TYR的含量明顯低于除空白組外的其他組別[19]。因此判斷電針可能通過改善機體內的E2與TYR的水平以治療此病。

2.3.2 西醫方面研究發現,背部脫毛的豚鼠在中波紫外線照射及不同濃度E2處理7 d后,背部色素沉著呈遞增狀態,而黑色素細胞與KC經皮膚CT觀測,其形態及數量變化也尤為明顯[45],主要是由于中波紫外線照射可刺激黑色素的表達并促進色素沉著。研究證實雌激素不僅能增加TYR含量,且在一定程度上可促進黑色素的生成[46]。由此判斷雌激素在黃褐斑形成的過程中發揮著不可或缺的作用。

綜上,中西醫對黃褐斑激素水平調節的機制主要是從雌激素的角度進行闡述,相比于其他機理論述而言相對單一,且中西醫針對這一機制的治療方式研究也明顯不及上述。

3 討論

當前,黃褐斑造模的方法以發病因素為主,標準不一,不同造模方式中缺少中西醫證型的體現,同時文中所涉及的造模方式均未能對應到證中,中醫方面僅有一篇有關黃褐斑證候的基礎研究[47],而西醫方面同樣也僅有一篇相關研究[48]。因此,今后要大量開展模型比較研究,以明確最佳建模方式,從而盡快制定統一的模型制備方式,同時研究人員應根據實驗設計需求從中西醫角度出發,側重理論和證型的結合,構建有關中西醫黃褐斑分型的統一模型,以便在造模期間隨時調動建模方案。

隨著社會經濟的快速發展、環境及精神壓力的影響,黃褐斑患者也呈直線上升的趨勢,因此研發有效的藥物成為迫在眉睫的任務。日前,證明治療方式有效性的研究不僅限于臨床,基礎研究也在不斷增加,但基礎研究數量仍不及臨床研究。此外,實驗研究上,一方面中西醫對模型機制研究不夠全面,僅關注于黑色素合成、抗氧化、激素紊亂等發病機理,缺少對其他機理(皮膚異常菌群、血流狀態等)的探討,另一方面,中西醫對上述機理闡述時所選用的評價指標過于片面,未從其他通路或炎癥因子角度入手對其治療方式予以評價。此外,在對黃褐斑模型治療方法評價的研究中,對中西醫結合治療的評價研究甚少,因此未來要繼續完善對黃褐斑模型其他致病機理的研究,探索更全面、更規范的機制評判指標[49],同時加強對中西醫結合治療的實驗研究,以使得評價更為完善,研究更加深入?？傊?通過對以上不足的改進,定可推動中西醫治療黃褐斑的研究進展。