自噬在肝細胞癌發病中的作用*

李蕭雨,楊星,王振,李素領

1.河南中醫藥大學,河南 鄭州 450046; 2.河南中醫藥大學第一附屬醫院,河南 鄭州 450000

原發性肝癌在我國常見惡性腫瘤中位列第4。在原發性肝癌的3種類型中,肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)以75%～85%占比位居高位,嚴重威脅人們的生命和健康[1]。隨著研究深入,更深刻復雜的自噬與HCC關聯機制逐漸顯露。自噬即“自我吞噬”,自噬現象僅存在于真核細胞,目的是通過吞噬細胞自身“有害物質”達到維持機體內環境穩定和物質循環利用。研究證實,對腫瘤的有效干預可通過促進或抑制自噬來實現[2-3]。自噬在HCC早期進程中起到抑制作用;而后期則呈現一定程度正向作用[4-5]。正邪理論源自《黃帝內經》,通過宏觀角度把握疾病發生發展,判斷疾病預后,是中醫學重要宏觀思維之一[6]。將宏觀正邪理論與微觀自噬聯系發現,自噬對HCC的雙向調節與中醫正邪交爭有異曲同工之妙?；诖?本文立足于正邪理論,討論自噬在HCC進展中的作用,以期為HCC發病機制提供中醫理論,為診療HCC提供新理念。

1 自噬的概念及功能

自噬是指在自噬相關基因介導下,利用溶酶體降解自身受損細胞器以及某些大分子物質的過程,在維持細胞內環境穩態方面有著獨特作用,屬于程序性細胞死亡,其醫學概念誕生于20世紀50年代[7]。根據自噬發生方式的不同,自噬分為分子伴侶介導自噬、巨自噬和微自噬[8]。巨自噬是目前研究較為深入的自噬。自噬作為持續性研究熱點,有研究發現,其與眾多疾病,如代謝相關性肝病、肝纖維化、肝癌等存在相關性[9-13]。自噬進程一般分為自噬激活、自噬小體生成、自噬-溶酶體融合、內容物裂解釋放4個階段[14-16]。

1.1 自噬激活一般情況下,機體自噬維持在較低水平,特定應激條件下自噬被激活,自噬水平升高。能量缺乏、蛋白過度聚集、缺氧條件、某些凋亡信號產生、病原體的感染等均是自噬水平升高的誘因。其中,UNC-51樣激酶(ULK1)與Ⅲ型磷脂酰肌醇 3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases,PI3K)復合物是自噬激活的兩個核心位點。ULK1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,其與Atg13、FIP200、Atg101組成ULK1自噬調節復合物,該自噬調節復合物的激活是自噬發生的主要上游因素[17]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)作為ULK1復合物上游調控因子,是PI3K激酶家族成員,在自噬調節中有重要作用,mTOR與不同蛋白亞基結合形成mTORC1與mTORC2兩種復合物。mTORC1調控著自噬前體形成、自噬前體延伸、自噬溶酶體融合等多個自噬進程[18-19]。營養充足條件下,mTORC1可通過mTORC1-AMBRA1-TRAF6信號途徑與磷酸化ULK1復合物Atg13、S757、S258位點的方式同時抑制ULK1復合物活性進而阻止自噬發生。研究表明,營養富足條件下,mTORC1還可抑制ULK1復合物下游效應因子(如VPS34復合物1)的活性進而抑制自噬的開始[20]。而營養缺乏時,mTORC1失活,從而導致自噬發生。mTOR受腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)、PI3K-1/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又稱AKT)、p53等信號通路影響,其中,對ATP高敏的AMPK關聯多個信號通路[21],在饑餓或細胞能量缺乏狀態下被激活,活化的AMPK促進ULK1復合物發生磷酸化,抑制mTORC1途徑,進而激活自噬信號[22]。與ULK1并列的Ⅲ型PI3K復合物由PI3K-3、Beclin1、Atg14、p150等亞基組成,與腫瘤密切相關的Bcl-2因子可與Beclin1競爭性結合,抑制Ⅲ型PI3K復合物的形成,進而抑制自噬現象發生[23]。在某些應急條件下,上游特定信號分子使得Bcl-2磷酸化,磷酸化Bcl-2無法再拮抗Ⅲ型PI3K復合物合成,自噬被激活。

1.2 自噬小體生成ULK1與Beclin1相互作用后激活Vps34復合物活,該復合物磷酸化磷脂酰肌醇(PI3P)后促進了自噬體膜擴展[24]。自噬相關蛋白Atg7與Atg10泛素樣化后與Atg5藕連,結合Atg12后形成Atg5-Atg12復合物,該復合物再與Atg16聯合形成Atg12-Atg5-Atg16復合物[25]。另外,Atg19復合物與Atg11相互作用并與泛素樣蛋白Atg8接觸后,與磷脂酰乙醇胺(PE)連接形成 Atg8-PE復合物。Atg12-Atg5-Atg16和Atg8-PE復合物與跨膜蛋白Atg9一起加入到自噬小體,調控自噬小體擴張[26]。而對擴張所需自噬體膜的來源,尚不明確,主流學說有內質網膜學說、線粒體膜學說、內吞體學說等[27]。

1.3 自噬體-溶酶體融合與內容物降解釋放在該階段中,LC3蛋白羧基端被Atg4酶切后形成胞漿型LC3-Ⅰ。LC3-Ⅰ在泛素化Atg3和Atg7體系下修飾后與PE藕連轉化為脂質型LC3-Ⅱ[28],LC3-Ⅱ 與p62蛋白等相互作用后促進自噬體內容物轉向自噬溶酶體,內容物在溶酶體酶作用下降解后溶酶體膜裂解,達到細胞新陳代謝、推陳出新的目的。此過程被中斷后,自噬進程中降解步驟將不能完成。

2 自噬在HCC發展中的作用

自噬調控HCC機制極其復雜,機體常態下,自噬維持在較低水平。應激狀態下,自噬被激活,一定程度的高水平自噬為細胞提供生命活動所必需能量。在HCC癌前狀態及早期進程中,細胞通過自噬降低不利因素水平,維持自我穩定,抑制腫瘤進展;當HCC發展到一定階段,突破常態的腫瘤細胞又可利用自噬機制適應缺氧、能量缺乏等環境,加速HCC進展[4]。研究發現,自噬作為一把“雙刃劍”,在腫瘤不同階段表達水平有顯著差異[29]。有研究發現,ATG5敲除的自噬缺陷小鼠模型中,小鼠發生肝良性腫瘤但不惡變[30],進一步證實了自噬現象在HCC進程中具有雙向調控作用[5]。自噬通過復雜的機制調控HCC的生長、轉移等進程,腫瘤相關基因p53、Ras及相關蛋白mTOR、Bcl-2、Bax、PI3K等交叉關聯[31],與參與自噬的LC3蛋白、Beclin1蛋白、P62蛋白相互作用,在HCC不同階段起到促進或抑制作用。

2.1 自噬對HCC發生發展的抑制作用自噬通過多種途徑抑制HCC的發生發展。自噬相關蛋白ATG缺乏、p62蛋白積累、炎癥因子介導、IFN-γ活性減弱等因素在HCC進程中具有重要作用[32],而在癌前狀態及HCC早期階段,自噬可通過調控上述因素抑制HCC進程[33]。

炎癥因子的持續刺激是導致HCC發展的重要因素。自噬可通過抑制炎癥因子間接減緩HCC進展。研究發現,降低白細胞介素-35(interleukin-35,IL-35)水平能提高LC3-Ⅱ與Beclin1表達水平,促進自噬,進而降解p62蛋白,抑制腫瘤發生[34]。炎癥趨化因子17能降低自噬水平,并通過相關通路刺激HCC侵襲[35]。實驗表明,敲除ATG16L1的小鼠中,自噬現象明顯減少,炎癥因子IL-1β、IL-18顯著升高,刺激細胞向癌細胞的轉變[36]。p62蛋白是用于檢測自噬水平的標志性自噬底物[37],自噬現象維持細胞內p62蛋白正常水平,該蛋白過度累積可能促進HCC發生。有學者發現,在HCC組織中具有大量p62細胞內透明體[38],細胞中高水平的p62表達通過激活mTORC1通路免除癌細胞死亡,并通過Wnt/β-catenin經典通路調控肝癌細胞轉移[32]。因此,自噬現象通過降解p62蛋白在一定程度上抑制HCC發生。有分析顯示,Beclin1的表達可負向調控HCC中的AFP、肝硬化和血管侵犯程度,可用于判斷預后[39]。Kiruthiga等[40]發現,腫瘤抑制因子受Beclin1通路影響,激活該通路可提高自噬水平發揮抗腫瘤效應。實驗表明,Beclin1缺乏的小鼠因自噬水平明顯不足,HCC形成風險顯著增加[41]。有研究證實,自噬可增強IFNγ活性進而抑制HCC進展[42]。

2.2 自噬對HCC發生發展的促進作用自噬在HCC中后期階段的增殖、轉移、浸潤等過程中具有重要作用,腫瘤細胞生存于低氧環境下,低氧誘導因子HIF1α通過特定途徑促使自噬現象產生,由自噬介導的高遷移率族蛋白HMGB1與胞質中mtDNA作用,通過激活TLR9通路。同時,缺氧環境誘導mTOR通路下調,共同促進腫瘤細胞生長[43]。研究表明,自噬可通過介導某些黏附信號調控肝癌細胞的轉移,抑制自噬水平后HCC肝外轉移明顯減少[44]。Li等[45]發現,Beclin1信號通路可受上游因子骨形成蛋白4調控抑制HCC的侵移能力。Liang等[46]通過靶向干預肝癌細胞,敲除叉頭框蛋白后,自噬水平被抑制,進而抑制HCC增殖。

上皮-間充質轉化(epithelial-tomesenchymal transition,EMT)是腫瘤發生發展重要機制,可通過HIF-1α、Wnt/β-catenin、AKt/PI3K/mTOR等多條信號通路調控HCC進展[47]。自噬與EMT之間存在復雜聯系,在腫瘤細胞中,自噬對EMT存在促進與拮抗雙重作用[48],這可能與HCC分級有關。在中晚期HCC階段,自噬可能通過促進EMT調控HCC轉移擴散。有實驗證實,在肝癌細胞中加入自噬抑制劑或敲低ATG3,可導致EMT降低,減少HCC侵害[49]。

氧化應激是指機體細胞氧化還原失衡狀態,在HCC中,氧化應激可能和缺氧條件相互影響,腫瘤細胞持續的炎癥刺激及高水平增殖能力均與氧化應激相關。氧化反應產生一定活性氧(reactive oxygen species,ROS),ROS過度積累超出氧化應激機制負荷后氧化還原穩態失衡,正常細胞受損。核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)與Keap1組成的復合物是維持正常氧化反應的重要屏障,腫瘤細胞中堆積的p62與Nrf2競爭性結合Keap1,導致Nrf2激活,促進了HCC發展[50]。有研究表明,自噬水平升高可通過降解氧化線粒體和脂質減緩ROS對肝癌細胞的損傷[51]。

3 “正邪理論”與細胞自噬的相關性

3.1 自噬穩態與正氣正邪之爭貫穿于疾病發生發展進程,并決定疾病預后。正氣充盛,邪氣衰弱則病情較輕,病程較短,預后良好;正氣羸弱,邪氣強盛則病情為重,病程綿長,預后多差?；谡袄碚摰陌l病觀認為,正氣虛弱是疾病產生的內在前提,賊邪盛猛是外在因素,疾病是二者相互作用的結果,交相影響,不可分割。常態下,正氣在機體中發揮平和的溫陽作用;應激狀況下,正氣發揮奮起抗邪的抵御作用。而自噬作為機體生而兼具的生理機制,本身屬于正氣范疇,可發揮以下作用:常態下,低水平自噬通過“推陳出新”維持細胞內環境穩態與物質循環利用,類似正氣平和溫陽的作用;一定程度應激條件下,自噬水平適度升高,加速細胞新陳代謝,或者通過主動誘導程序性死亡的方式來抵抗細胞不可逆進程,類似正氣抵御邪氣的作用。當機體受到邪氣侵襲,特定上游信號調控自噬通路激活,細胞主動降解已損害細胞器等為機體提供充足能量,猶如邪氣初犯,正氣應激鼓舞,奮起抗邪。若邪氣久留,自噬受上游信號持續激活,過多細胞器及蛋白質被分解,大量細胞程序性死亡,導致機體內病理產物累積,猶如邪氣不服,正邪拉鋸,日久消磨正氣,邪氣雖衰而正氣亦羸,導致痰濁、水濕、血瘀等多種實邪內生。

3.2 自噬失衡與邪氣研究表明,過高水平自噬或過低水平自噬均可導致疾病產生[52-53]。這與正邪理論正氣不及與邪氣太過的發病觀異曲同工。賊邪迅猛太過相當過高水平自噬;正氣虛弱不足相當過低水平自噬。筆者認為,自噬現象是宏觀正邪理論在微觀角度的體現,正邪理論是包括自噬在內諸多微觀機制的宏觀總和。不難看出,自噬的本質是具有一定限度的細胞自我保護機制,該機制只在一定程度內穩定。HCC癌前狀態及早期階段,肝細胞自噬水平的顯著降低,提示機體正氣已被邪氣壓制,此時應以提高自噬水平,清除細胞累積過多的損壞細胞器及蛋白質(攻邪)為主,兼顧扶正;中后期階段肝癌細胞又可利用高水平自噬交聯其他機制,為自身增殖轉移提供充足能量供應并預防凋亡發生。此時癌毒頑固,正氣日久不支,治療應以扶正為主,兼顧祛邪。

4 歷代基于正邪理論對HCC的研究

正邪理論為中醫獨特理論,由《黃帝內經》首次提出[6]?！饵S帝內經》中正氣尚帶有四時八風、時令方位之氣的致病性。本文“正氣”的概念以宋代《素問遺篇》中“正氣存內,邪不可干”生理性概念為參考[54],泛指機體免疫力、抗邪能力、恢復力等正向作用力;邪氣則泛指外感六淫、內傷七情、濕毒痰瘀等[55]。關于正邪應用,后世醫家或重扶正、或重攻邪,但均以正氣為本,邪氣為標。扶正祛邪已成為中醫治療疾病的宏觀大法。HCC在中醫學中無固定病名,依據臨床癥狀,可將其歸于“臌脹”“癥瘕”“肝積”等范疇?！肮拿洝币辉~首見于《黃帝內經》,后人多作“臌脹”?！陡裰掠嗾摗酚涊d:“清濁相混,隧道壅塞,氣化濁血瘀郁而為熱……《經》曰臌脹是也?！薄峨y經·五十六難》首先提出五臟之積的概念,其中“肝之積,名曰肥氣,在左脅下,如覆杯”又將肝積稱為肥氣。李東垣據此創制“肥氣丸”治療肝積,多被后世沿用?！夺t宗必讀》記載:“積之所成,正氣不足,而后邪氣踞之?！敝赋隽苏敖粻幵诜e聚發病中的作用?！鞍Y瘕”一詞首見于《傷寒論》,曰:“此結為癥瘕,必有瘧母,急治之,宜鱉甲煎丸?！薄夺t碥》記載:“瘕疝積聚之類,(脈)沉實有力可治,虛弱者死?！币悦}象揣度機體正氣,指出了正氣在癥瘕積聚中的重要作用。關于癥瘕的中醫病機,《馮氏錦囊秘錄》記載:“癥者,定于一處而不移。瘕者,是因傷血得之……又名血結?！鄙鲜龉偶涊d的“臌脹”“癥瘕”等均有血瘀的基本病機,HCC諸多中醫證型中以血瘀證最多[56]。正如《醫宗金鑒》歌括記載:“五積六聚分臟腑,七癥八瘕氣血凝?！惫P者認為,HCC遷延難愈,久來正氣必虛,而肝木之病,最侮脾土,土虛精微失去正化而成瘀成痰,故基于正邪理論,HCC以正虛為本,以痰濁、血瘀實邪為標。

5 中醫藥現代研究進展

穩固正氣、祛除邪氣是中醫治療疾病追求的目標,也是疾病向愈的必然要求。實際臨證中,臨床應注重個人體質差異及疾病特質,扶正與祛邪有所側重、有所兼顧,針對病癥有是之證,用是之藥。辨證與辨病相結合對所立處方有的放矢,達到治愈疾病、緩解癥狀的目的。自噬作為機體細胞高度保守的調節機制,在HCC發病進程中具有重要且復雜的作用。

5.1 促進自噬進而抑制HCC早期進展在HCC癌前狀態或早期階段,應通過提高細胞自噬活性,加速細胞“推陳出新”力度,側重攻邪進而祛除細胞代謝生成過多的痰瘀實邪產物,防止邪氣過度侵蝕而肝細胞自噬水平長期受抑致使細胞加速向癌轉化。臨床常選用化痰除濕、化瘀散結的中藥攻邪,如紅花、丹參、防己、鱉甲煎丸等。研究發現,化痰除濕類中藥粉防己中的粉防己堿可通過激活自噬或逆轉EMT,抑制Wnt/β-catenin信號通路活性進而抑制HCC進展[57]?；鲱愔兴幍⒖梢种颇[瘤相關因子表達、逆轉EMT,降低HCC侵蝕性[58],其有效成分丹參酮還被證明有促進LC3-Ⅰ與LC3-Ⅱ轉化誘導自噬,抑制HCC發病的作用[59]。紅花中的有效成分紅花多糖可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR的經典通路誘導癌細胞自噬和凋亡[60]。研究發現,鱉甲煎丸可顯著改善HCC患者癥狀、延長生存期[61]。研究表明,苦參堿可抑制肝癌進程,其作用機制可能是通過抑制p-MTOR蛋白的表達上調自噬,進而發揮抗腫瘤作用[62]。另外,山藥中有效成分薯蕷皂莢通過抑制mTOR表達提高LC3與Beclin1水平,促進自噬進而抑制HCC進展的作用已被證實[63]。

5.2 抑制自噬進而減緩HCC中晚期進展在HCC中晚期階段,癌細胞通過自噬獲取充足能量供應,正常細胞長期受累,癌毒瘀阻,正氣遷延日損,無力驅邪外出。此時,以側重扶正固本為主,兼顧祛邪。臨床常選扶正固本、益氣養脾之品培補正氣,如生曬參、黃芪、山藥等。中藥通過多通路、多靶點干預HCC,在緩解癥狀、化療增敏、延緩進展等方面有顯著作用。黃芪中的黃芪多糖也可調控Bcl-2的表達抑制自噬,進而發揮抗腫瘤作用[64]。人參皂苷CK也可通過調控自噬經典通路誘導肝癌細胞BEL-7404自噬[65]。lncRNA介導多種癌癥發生,在調控肝惡性腫瘤進程中具有重要作用[66]。有研究證實,鱉甲煎丸可通過調控lncRNA SNHG5/miRNA-26α-5p/GSK-3β信號軸干預小鼠肝癌進展[67]。

6 “扶正祛邪”指導HCC的治療

在HCC中醫辨治經驗中,以正邪理論為指導,按照病患體質及HCC分期針對性用藥十分重要。研究表明,氣虛血瘀證為肝癌最常見證型,且在肝癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期中虛證分布具有顯著差異[68]。國醫大師周仲瑛認為,肝癌以瘀毒內蘊、肝脾虛傷為基本病機,常用藥物有八月札、土鱉蟲、穿山甲、莪術、鱉甲、水紅花子等[69]。有文獻提出,肝癌早期,正氣未衰,治療應側重祛邪解毒化瘀,中晚期正虛邪戀,治療以扶正為主[70]。辛凱旋亦認為,正虛是肝癌發病基礎,氣滯瘀毒為病理因素,治療善用丸劑取效[71]。董克禮認為,本虛標實是HCC根本病機,治療時以扶正祛邪為本,重視活血化瘀之法[72]。趙文霞十分重視血瘀在原發性肝癌中的重要作用,基于不同肝癌階段,從破血逐瘀、活血化瘀、搜絡祛瘀論治肝癌[73]。李素領認為,正氣不足、瘀毒互結是HCC的基本病機,在該病機基礎上提出“四攻一補”的基本治則,并針對患者體質、病程階段及次要兼證平衡正邪關系[74]。由此可見,中醫正邪理論可用于指導細胞自噬在HCC治療中應用,并有助于更深入研究自噬調控HCC的作用機制。在癌前狀態或HCC發病初期,借助自噬機制,以中醫正邪理論為指導調控自噬水平太過與不及,從而維持機體正邪穩態平衡可能是防治HCC的重要新思路。

7 結語

正邪理論是中醫宏觀把握疾病變化的重要方法,貫穿疾病發生、發展、康復整個進程;自噬是現代醫學從微觀角度了解生命現象的重要機制,在調控HCC進程中有著重要作用。目前,自噬進程整體機制尚未被完全闡明;中藥調控自噬的雙向性及自噬在HCC中的雙向作用關聯亦有待分析;通過中藥干預自噬機制來治療HCC與其肝癌分期的關系較為模糊。隨著微觀自噬機制研究的不斷深入,正邪理論或可作為指導,有助于深入理解復雜自噬機制,并發揮中醫藥特長,為中西醫結合防治HCC提供新思路,為HCC現代科學研究提供中醫學理論支持。