中性粒細胞外誘捕網在肝細胞癌轉移中的作用機制及應用價值研究進展

吳穎升,梁向娟,彭嘉敏,黃晶晶,2,RASSUL(哈薩克斯坦)

(1.廣西中醫藥大學,廣西 南寧 530023;2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院,廣西 南寧 530023;3.陜西中醫藥大學,陜西 咸陽 712046)

肝癌是世界常見的惡性腫瘤之一,肝細胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是原發性肝癌(Primary liver cancer, PLC)中最常見的類型[1]。手術切除是目前HCC治療的重要手段,但是術后高復發和高轉移成為了影響患者5年生存率的主要因素,目前我國肝癌晚期患者5年生存率仍在20%以下,即使是直徑小于3 cm的亞臨床肝癌患者,肝切除術后5年復發率也高達43.5%[2]。肝癌轉移是由肝癌細胞與腫瘤微環境間相互作用,通過炎癥浸潤、免疫抑制、新血管和淋巴等途徑進行轉移,其潛在分子機制仍未完全了解。為此,闡明肝癌轉移的分子調控機制,挖掘其潛在治療靶標在降低肝癌轉移率及提高患者5年生存率上有著深遠的意義。

中性粒細胞是先天免疫系統中最豐富的效應細胞,是不同類型腫瘤內的主要組成部分,在癌癥轉移和患者預后中發揮重要作用[3-4],肝癌中的可溶性因子誘發中性粒細胞中功能性自噬相關因子微管相關蛋白1輕鏈3 (Microtubule-associated protein1 light chain 3,MAP1LC3)和自噬體的顯著增加,從而促進HCC轉移,與中性粒細胞直接相關并共同存在于腫瘤炎癥微環境中的中性粒細胞外誘捕網(Neutrophil extracellular traps,NETs)同樣被證實與腫瘤進展及轉移有關[5-6],并成為近幾年的研究熱點。

1 中性粒細胞與NETs

中性粒細胞是重要的固有免疫細胞,其免疫功能包括吞噬作用、活性氧(ROS)產生、脫顆粒以及NETs形成與釋放[7]。中性粒細胞產生NETs的方式有兩種[8]:一種是自殺式NETosis,另一種是活力型NETosis。這兩種途徑在誘導因子、釋放方式和形成后中性粒細胞特征等方面存在差異,自殺式NETosis主要由宿主自身抗體和免疫因子誘發以穿透包膜的方式釋放,釋放后中性粒細胞死亡?；盍π蚇ETosis由生物因子誘發以囊泡出芽形式釋放胞外,形成后中性粒細胞核膜完整,吞噬功能正常。NETs在2004年被BRINKMANN 等[9]發現并命名,并明確其是由中性粒細胞受到各種因素釋放,途徑是還原輔酶I(NADH)激活Raf/Merk/ErK信號通路的氧化反應,其結果是構成由線粒體DNA為主體,由組蛋白與顆粒蛋白修飾的立體網狀結構。NETs的成分髓過氧化物酶(MPO)和防御素具有抗病毒作用,能抑制病毒活性,還能通過NADPH氧化酶產生的ROS、肽?；彼崦搧啺访?(PAD4)、中性粒細胞彈性蛋白(NE)和染色質的脫縮來殺死病原體[10-12]。這些作用的前提是NETs的表達在未失調的范圍。相反,如果NETs失調,就會引起組織損傷并促進免疫相關疾病的發病,如NETs會導致所有形式的血栓形成、微粒誘導的炎癥、自身免疫性血管炎、自身炎癥性疾病以及缺血性、毒性或創傷性組織損傷引起的繼發性炎癥[13]。近年來,已有大量動物模型和腫瘤患者數據表明,NETs參與了腫瘤的進展和轉移。NETs在腫瘤中發揮的潛在生物學作用逐步被發掘,包括腫瘤的發生、進展、轉移及對治療藥物的耐藥性等。

2 HCC轉移與NETs

肝臟疾病進展為HCC需經歷三個階段,首先是由不良生活方式引發的脂肪肝后發展為肝炎,繼而導致部分肝臟發生肝硬化,最后演變為HCC,其中有很大一部分患者從代謝性脂肪性肝炎(NASH)直接進展為HCC,沒有經歷肝硬化這一過程[14],這表明了炎癥在癌癥發生和發展過程中的重要性[15]。DIR等[16]研究發現,通過建立C57BL/6小鼠STAM-NASH模型,在造模第5周出現中性粒細胞浸潤,至第20周所有模型小鼠進展為HCC,且在肝臟組織切片中觀察到NETs特異性標志物瓜氨酸化組蛋白H3(cit-H3)的表達,這表明中性粒細胞參與了NASH的過程并產生了NETs,NETs又促進NASH進展為HCC。應用脫氧核糖核酸酶(DNase)給藥治療與敲除PAD4后,STAM-NASH模型小鼠肝臟表面腫瘤體積變小及數量減少,證明靶向NETs能減緩NASH向HCC進展。YANG等[17]通過免疫熒光染色直接觀察HCC患者肝臟組織中cit-H3和MPO的表達來證明HCC微環境中的中性粒細胞能夠形成NETs。此外,具有高轉移潛力的HCC細胞可以通過一些分泌因子誘導正常的中性粒細胞形成NETs。

NETs能促進HCC的生長和轉移。在HCC組織中產生的缺氧環境可以引起細胞壞死后釋放損傷相關分子模式(DAMPs)相關分子,如高遷移率族蛋白B1(HMGB1)和線粒體DNA(mtDNA)。這些DAMPs分子與其受體相互作用,觸發促炎信號級聯反應,導致腫瘤進展。HMGB1通過介導mtDNA和Toll樣受體-9 (TLR9)的結合以及隨后促腫瘤信號通路的激活,在缺氧期間的TLR9激活中起關鍵作用[18],被激活的TLR9在HCC中過表達并促進缺氧引起的HCC進展。為了證實缺氧環境引起的TLR9與NETs的形成有關,TOHME等[19]通過誘導小鼠缺氧,并將缺氧小鼠的中性粒細胞與佛波酯(PMA)處理的中性粒細胞進行對比,結果顯示兩者NETs形成顯著增加,如免疫熒光染色中cit-H3表達增加;同樣,在配對的人轉移性結直腸癌組織樣本及其相應的非腫瘤肝組織中,缺氧誘導因子1 α(HIF-1α)和cit-H3在復發性轉移性結直腸癌腫瘤中的表達更高。這些結果表明,在生長中的腫瘤中存在的缺氧環境中,手術應激后NETs形成急劇增加。通過評估1985至2011年的2019例行肝切除手術的HCC患者的HCC組織cit-H3的表達,發現在患有門靜脈腫瘤血栓形成或肝外轉移的HCC患者組織標本中觀察到的cit-H3表達明顯更強于沒有轉移的HCC[20]。JIANG等[21]發現中性粒細胞釋放NETs的浸潤水平與患者生存呈負相關,與HCC患者腫瘤轉移電位呈正相關。該研究組從能量代謝的角度探索發現糖酵解的上調通過NADPH氧化酶-ROS途徑在這些細胞中觸發了NETs的釋放。隨著NETs在肝移植領域的研究的深入,多項研究發現,DAMPs包括HMGB1和肝臟缺血再灌注損傷過程中釋放的組蛋白或超氧化物,與NETs的形成有關,NETs促進庫普弗細胞M1極化和HMGB1加重肝臟缺血再灌注的細胞內易位,甚至導致肝移植后急性移植排斥反應[22]。GUAN等[23]通過評估2019例肝切除術患者獲得了cit-H3在HCC組織中沉積的組織學證據,表明在患有門靜脈癌栓或肝外轉移的HCC患者組織標本中觀察到的cit-H3表達明顯更強于無轉移者,為了進一步評估組織微環境中NETs的存在是否與疾病預后相關,分析了相同的80組組織標本cit-H3水平與存活率間的相關性,結果表明cit-H3組織表達較高的患者生存率較低。這些研究結果表明NETs與HCC轉移相關,大多經過反復的炎癥反應促進細胞增殖、新血管生成、上皮細胞間充質轉化和細胞外基質降解。

2.1 NETs促進HCC血管生成 HCC是典型的多血供腫瘤,血管生成在HCC生長和轉移中均起到重要作用。血管的生成是一個復雜的形態學過程,受促血管生成因子群和抗血管生成因子群的調控,血管內皮生長因子(VEGF)是重要的促血管生成因子,炎性反應中環氧化酶-2(COX-2)能刺激VEGF過表達[24]。COX-2是腫瘤炎癥微環境成分,可被炎癥因子激活。中性粒細胞聚集和NETs形成可以調節關節炎等炎癥性疾病中的COX-2[25]。ZHAO等[26]通過體內與體外實驗發現,使用COX-2抑制劑減少HCC細胞COX-2的表達,與來自未經處理的HuH-7細胞相比,處理后的HuH-7細胞抑制了人體外臍靜脈內皮細胞和血管的生成,作用機制是下調促血管生成因子如VEGF、肝細胞生長因子(HGF) 、成纖維細胞生長因子2(FGF2)、血管生成素1(Ang-1)和血管生成素2(Ang-2)在HCC中的表達。NETs還能通過Toll樣受體2(TLR2)激活COX-2從而增強腫瘤的轉移[27]。YANG等[17]還發現,NETs可以通過激活TLR4/9-COX-2信號通路誘導炎癥反應,釋放細胞因子和趨化因子吸引免疫細胞釋放生長因子和蛋白酶,誘導血管生成,促使HCC發生轉移。NETs的主要成分組蛋白是其促進血管生成的另一重要原因。NETs能夠通過相關的蛋白酶[如基質金屬蛋白酶9(MMP-9)、NE] 溶解胞外基質 (ECM),從而釋放 VEGF[28],以提高腫瘤侵襲和血管生成的能力。在臨床實驗研究中,手術引發的缺血再灌注損傷能夠通過上調HCC組織中VEGF表達使腫瘤轉移的可能性增加,近年體內動物實驗[29-30]也證實大腸癌肝轉移模型小鼠血清比正常小鼠血清的HGF、VEGF水平升高,其機制與促血管生成因子促進腫瘤血管生成相關。JUNG等[31]將內皮細胞與不同濃度組蛋白共同培養4 h后置于顯微鏡下觀察毛細血管狀結構的生成,用Image J軟件分析血管的大小與長短,為了確認結果的特異性,設立組蛋白抑制劑肝素和PSA[32-33]與內皮細胞共同培養,后將結果進行對照,抑制劑組血管生成減少,其原理在于陰離子屬性抑制劑與帶正電荷組蛋白結合使其活性降低。NETs還通過激活和清除衰老內皮細胞以及進一步上調促血管生成因子來促進血管生成。癌前衰老細胞促進腫瘤轉移與其不穩定的基因組和失調的微環境引發慢性炎癥形成的促瘤環境有關。癌前衰老肝細胞免疫監測受損導致鼠HCC的進展[34],對含有癌前衰老肝細胞的小鼠肝臟的顯微鏡影像顯示,在形態學改變的衰老肝細胞周圍有大量免疫細胞的炎癥反應,炎癥趨化因子刺激促血管生成因子導致血管生成。

2.2 NETs誘導HCC細胞上皮間充質轉化 上皮細胞間充質轉化(EMT)是癌癥侵襲性轉移播散的關鍵過程,其經歷從上皮到間充質表型的多種動態過渡狀態,特征在于上皮細胞標志物如細胞角蛋白(CK)和鈣黏附蛋白E(E-Cad)缺失,間充質細胞標志物如鈣黏附蛋白N (N-cadherin)、波形蛋白和纖連蛋白(FN)的表達上調。許多數據證實NETs促進腫瘤EMT的形成,進而導致腫瘤的侵襲與轉移,在結腸癌[35]、胃癌[36]、乳腺癌[37]等中都有發現NETs通過EMT促進了腫瘤轉移。炎癥反應促進EMT的形成,NETs與炎癥反應的關系密切。當HCC細胞發生EMT時,HCC細胞失去上皮細胞的特性,轉化為具有遷移侵襲能力的間質細胞特性,在EMT轉化過程中發生了明顯的細胞骨架重建,改變多種與EMT相關的轉錄因子、細胞表面受體的表達。JIN等[37]研究發現,NETs通過白介素-1β(IL-1β )/ EGFR/ERK途徑促進癌細胞中的EMT。NETs能通過激活Ras/Raf/Mek/Erk信號通路,上調促炎因子IL-6、IL-8、IL-1β及腫瘤壞死因子-α (TNF-α)的表達[38],在腫瘤與正常組織間持續招募免疫細胞,如巨噬細胞和肥大細胞,從而形成炎性腫瘤微環境。由于慢性炎癥產生的炎性胞因子失衡及對免疫系統的抑制作用,細胞因子通過降解基底膜和細胞外基質成分為腫瘤離開基底膜、浸潤和轉移到正常組織創造了條件,有助于腫瘤細胞離開原發腫瘤部位,向局部正常的外周組織浸潤、侵襲。細胞因子還可通過相應的受體激活不同的信號傳導通路,誘導EMT的形成。LIN等[39]通過對系統性紅斑狼瘡與COVID-19進行轉錄分析,明確NETs通過上調EMT關鍵轉錄因子α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、Twist、Snail蛋白表達同時降低EMT特征性分子E-cadherin蛋白表達來促進EMT。WANG等[40]研究表明NETs通過下調miR503HG表達激活NF-κB/NLRP3通路,促進EMT和肺癌轉移。

ZHAN等[41]通過實驗驗證了HCC、NETs和EMT三者的關系,NETs刺激導致上皮標志物E-cadherin減少和間充質標志物Vimentin增加,細胞系的侵襲性增強,侵襲相關蛋白MMP-2和MMP-9的表達增加,HCC細胞被NETs包裹黏附性增強,當添加DNase I以減少NETs形成時,黏附的HCC細胞部分減少。在NETs干預30 d后NETs不僅增加了遠處肺轉移小鼠的數量,而且增加了肺中轉移集落的數量,該研究組還通過標志物鑒定NETs的表達來確認NETs在此實驗中對HCC轉移干預作用的特異性。同時期HU等[42]檢測通過COX-2介導EMT后HCC細胞的遷移與侵襲能力,評估HCC轉移與COX-2相關,COX-2信號通路能被NETs激活,這一理論的具體機制還需更多實驗數據去證實。EMT使上皮細胞失去了細胞極性,失去與基底膜的連接等上皮表型,獲得了較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解細胞外基質的能力等間質表型。闡明調控HCC發生EMT過程的分子機制,明確其在HCC的轉移中的病理意義,并探索基于EMT關鍵分子的診斷方法及靶向NETs關鍵分子的治療手段,有助于解決HCC轉移中的關鍵難題。

2.3 NETs降解HCC細胞外基質促進肝癌細胞浸潤 ECM是腫瘤微環境的重要組成部分,由蛋白質、糖蛋白和多糖組成。ECM作為細胞因子和生長因子的儲存庫,具有維持組織形態并調節細胞行為的功能[43]。ECM的降解突破基底膜是腫瘤細胞侵襲轉移的第一步。體內可以降解ECM的酶主要有三類:MMPs、纖維蛋白溶酶(PL)和NE,其中MMPs發揮主要作用。MMPs可以降解膠原蛋白、彈性蛋白、層粘連蛋白和纖連蛋白等多種ECM組分,按照底物可分為膠原酶、明膠酶、基質溶解素和基質溶解因子?；|金屬蛋白酶抑制因子(TIMPs)可以與MMPs結合并抑制其活性,從而在體內調控MMPs的ECM降解能力。NE可以獨立于NETs的形成而從中性粒細胞中釋放出來,同時也證明了NE在NETs的病理功能中起著重要作用。NE對于ECM的降解作用體現在其能與MMP-9依次切割層粘連蛋白[44],導致ECM結構紊亂,隨著ECM紊亂的增加,高膠原和彈性蛋白纖維堆積干擾自然殺傷細胞識別腫瘤細胞,增加的促血管生成生長因子VEGF、IL-8 、血小板衍生性生長因子受體-β (PDGFR-β)、MMP-9 和 MMP-14使腫瘤供血系統和腫瘤微環境更有利于腫瘤的生長和轉移。NE還參與細胞外基質重塑的炎癥反應,這個過程通過水解細胞外基質片段產生中性粒細胞和單核細胞的趨化性。這種炎癥反應會吸引額外的抗炎因子,從而縮短感染過程。此外,受損的基底膜釋放層粘連蛋白(是各種基膜的主要成分之一)片段促進中性粒細胞遷移和抗氧化因子募集,從而加速炎癥過程致腫瘤轉移發生。劉立友等[45]通過對75例肝癌切除術患者的腫瘤組織層粘連蛋白3(LAMA3)的表達與血管浸潤、淋巴結轉移的相關研究,表明LAMA3表達升高會促進PLC轉移。

在HCC中NETs通過促進MMP-2和MMP-9表達升高誘導ECM的降解,促進HCC轉移[41]。在一項關于乙型肝炎介導的NETs促進HCC生長和轉移的機制研究中,給予純化NETs干預HepG2細胞48 h后檢測細胞遷移和侵襲能力增強,Western bolt顯示侵襲相關蛋白MMP-2與MMP-9表達量上調,纖維蛋白表達量下調,使腫瘤微環境炎癥反應加重,ECM結構失調發生HCC轉移。這一研究提出NETs在有乙型肝炎病史的HCC患者和預后不良的患者體內激活休眠的HCC對ECM進行重塑,使TME更適合HCC細胞的增殖。有學者基于NETs的23個主要成分基因的基因集變異分析(GSVA),計算結果分析顯示,受NETs調控SPP1、MT1L和COL3A1等癌癥轉移相關基因的評分較高,這與ECM降解和泛癌危險因素的刺激有關,HCC是受這些基因調控的腫瘤之一。XIAO等[46]發現NETs抑制劑西維來司他鈉或DNase I在動物模型上能有效減少肺癌的轉移播種和定植,這是通過減弱了組織蛋白酶C(CTSC)的溶解作用,使ECM維持相對穩定的狀態,從而抑制了肺轉移,通過這項研究證實NETs的組分CTSG能夠加快ECM降解并促進腫瘤轉移。然而,對于關于NETs中的NE和其他蛋白酶在HCC中如何使ECM發生降解的直接作用機制的實驗數據仍然較少,中性粒細胞相關顆粒蛋白在ECM中的影響及腫瘤轉移的起始過程仍需進一步探討。

3 靶向NETs在HCC轉移治療中的應用

目前靶向NETs的治療關鍵主要在于抑制NETs的形成和促進已形成的NETs降解。破壞NETosis是抑制NETs形成的一種治療策略。鑒于NE和PAD4在NETosis過程中的關鍵作用,NE抑制劑或PAD4抑制劑也常用于防止NETs的釋放。氯脒是一種泛PAD抑制劑,能通過酶活性位點的共價修飾來不可逆地抑制PAD,被發現能夠抑制PAD4的表達,從而預防NETosis,目前已有使用氯脒靶向干預NETs運用預防結腸炎發展為結腸腫瘤。WANG等[47]通過建立小鼠模型證實了NET與調節性T細胞在NASH中呈正相關關系,兩者所塑造的免疫環境易促進NASH發展成HCC;在小鼠身上建立PAD4敲除模型能夠減少小鼠體內NETs的形成,抑制調節性T細胞的活性,從而抑制NASH進展為HCC。除了氯脒,新研發的GSK484與BMS-P5在抑制NETs發展和抑制相關疾病方面的功效現已得到幾項體外和體內研究[16]的證實。

NETs降解的靶向藥物也得到了許多驗證。DNase I 被公認為可以消化細胞外染色質和 NETs?；贜ETs通過激活腫瘤炎癥反應促進HCC轉移的研究[21]發現,采用抗炎藥物乙酰水楊酸(Aspirin)和羥氯喹(HCQ)阻斷COX-2和上游TLR4/9激活與DNase I互補,并通過多個角度證明了抑制HCC轉移的有效性。這些聯合療法可以阻斷或消化NETs,并通過未溶解的NETs消除被捕獲的HCC細胞的觸發轉移潛力。另一方面,DNase I在自身免疫性疾病中臨床應用,毒性不大,可降解全身性LPS添加誘導的NETs大量形成,有效消除HCC的實驗轉移。在HCC的原位小鼠模型中采用DNase I與HCQ或Aspirin對抗NETs,發現與單獨的DNase I相比,這種組合在抑制HCC的自發性肝內和肺內轉移方面顯示出更顯著的效率[17]。在進一步評估了NETs對小鼠體內腫瘤生長的影響后發現,從健康供體的外周血中純化中性粒細胞,并在不使用GSK2(PAD484抑制劑)干預的情況下,用HepG2人細胞系上清液處理,然后將處理后的中性粒細胞洗滌并靜脈注射到具有已建立肝內HepG2腫瘤的免疫缺陷小鼠體內。如與正常中性粒細胞對照相比,用腫瘤上清液預處理的中性粒細胞在腫瘤原位釋放(cit-H3信號)顯著增加,誘導的腫瘤在肺部產生更多轉移病灶。DNase I和PAD4均能原位拮抗腫瘤暴露-中性粒細胞治療組cit-H3信號的上調,顯著消除中性粒細胞誘導的體內腫瘤轉移。相比之下,腫瘤暴露的中性粒細胞不影響腫瘤原位生長。此外,當DNase I和GSK484腹膜內注射到已確診肝內Hepa57-6腫瘤的C1BL/6野生型小鼠中時,它們不影響體內腫瘤生長,但與對照組相比既能減少cit-H3細胞在腫瘤組織中的浸潤,又能阻止肺腫瘤轉移。這些數據表明,NETs可以促進小鼠體內腫瘤轉移。

4 結 語

HCC炎性微環境中的癌細胞、腫瘤相關中性粒細胞和NETs形成間的相互作用關系突出了NETs在HCC轉移中的作用。本文針對NETs在HCC轉移中的研究進行綜述,并簡要總結了NETs影響HCC轉移的干預方向。越來越多的證據表明,在某些癌癥中,通過直接抑制或抑制上游因子的表達和活性是一種高效的治療策略,所以抑制NETs的表達或者阻斷其上游信號通路的轉導有望成為HCC轉移的有效靶點。因此,需要進一步研究NETs在HCC轉移中的基本作用機制及其臨床相關性。