頭孢克洛聚合物雜質的分析

張丹丹?趙浩然?劉文坤?李寧寧?常笑?陳德俊

摘要：目的 對頭孢克洛中聚合物雜質的結構進行初步鑒定，對其產生機理進行初步分析。方法 以0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 8.0）為溶劑，室溫放置4 d，制備頭孢克洛強制聚合溶液；采用HPSEC法對強制聚合物溶液中各雜質進行分離，結合二維液相脫鹽技術、柱切換-LC/MSn技術，根據各雜質一級、二級精確質量信息及聚合機制，初步鑒定主峰前各雜質結構。結果 對頭孢克洛強制聚合溶液中的9個聚合物雜質結構進行初步解析，并初步分析其產生機理。結論 強制聚合溶液可作為頭孢克洛原料及制劑中聚合物雜質研究分析用系統適用性溶液。本研究中推測的聚合物雜質結構對頭孢克洛原料及其制劑的雜質譜研究及質量控制有重要參考意義。

關鍵詞：頭孢克洛；聚合物雜質；化學結構；柱切換-LC/MSn；二維液相色譜

中圖分類號：R978.1，R917文獻標志碼：A

Analysis of polymer impurities of cefaclor

Abstract Objective To identify the structures of polymer impurities in cefaclor raw materials. And the mechanisms of their production were analyzed. Methods The cefaclor forced-polymerization solution was prepared with 0.05 mol/L phosphate buffer （pH8.0） at room temperature for 4 days. The impurities in the forced-polymerization solution were separated by HPSEC method， and the structures of the impurities before the main peak were identified according to the primary and secondary precise mass information and the polymerization mechanism， combined with two-dimensional liquid desalination technology and column switching LC/MSn technology. Results Preliminary elucidation was conducted on 9 polymer impurity structures present in the cefaclor forced-polymerization solution. Concurrently， an examination was conducted on their mechanisms of production. Conclusions The cefaclor forced-polymerization solution can be used as suitable solution for the study and analysis of polymer impurities in cefaclor. The predicted polymer impurity structures in this study have important reference significance for the impurity profile study and quality control of cefaclor raw materials and their preparations.

Key words Cefaclor; Polymer impurities; Chemical structure; Column switch-LC/MSn; 2D-HPLC

β-內酰胺類抗生素是臨床廣泛使用的抗菌藥物，其原料與制劑在生產、運輸、存儲過程中易產生聚合物雜質[1]。β-內酰胺類抗生素中的聚合物雜質容易引發過敏反應甚至過敏性休克反應，但卻是其雜質譜控制中相對薄弱的環節[1-2]。隨著分析技術的進步，對β-內酰胺類抗生素中聚合物的認知也不斷深入[3-5]。

頭孢克洛（cefaclor）為第二代半合成頭孢菌素，最早由美國禮來制藥公司成功研制。其作用機制是通過與細菌的青霉素結合蛋白相結合，進而抑制細菌細胞壁的合成，臨床適用于敏感菌所致泌尿系統、呼吸系統、皮膚軟組織感染等[6-7]。頭孢克洛化學結構式見圖1，其C7位側鏈上有自由氨基，易于與另一分子β-內酰胺環聚合，從而生成頭孢克洛聚合物雜質。

目前，國內外藥典對頭孢克洛中的聚合物雜質均未予以控制。雖有文獻采用Sephadex G-10凝膠色譜柱[8]及TSKgel G2000SWxl色譜柱法[9-10]對頭孢克洛制劑中的聚合雜質進行測定，但是對頭孢克洛聚合物雜質的結構研究卻鮮有報道。本文采用二維液相色譜法結合柱切換-LC/MSn法對頭孢克洛原料中的聚合物雜質進行分析，結合頭孢克洛結構性質、雜質的質譜信息及聚合機制，推測聚合物雜質的結構并探討其可能來源。

1 材料與方法

1.1 儀器

MS105DU型電子天平，Thermo Q-Exactive plus二維高效液相色譜-質譜聯用儀（配有雙三元泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器、變色龍軟件、Q-Exactive plus質譜檢測器、Mass frontier7.0軟件）。

1.2 樣品與試劑

頭孢克洛原料藥（生產廠家：齊魯安替制藥有限公司）；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉（分析純；國藥集團化學試劑公司）；磷酸（分析純；天津科密歐化學試劑有限公司）；乙酸銨、乙腈（色譜純；Fisher Scientific）；去離子水為屈臣氏瓶裝純凈水。

1.3 高效凝膠排阻色譜（HPSEC）方法

色譜柱：TSK-gel G2000 SWxl（填料：球狀親水硅膠，300 mm×7.8 mm，5 μm）；流動相：磷酸鹽緩沖液[0.005 mol/L磷酸氫二鈉溶液-0.005 mol/L磷酸二氫鈉溶液（61：39）]- 乙腈（94：6）；檢測器：263 nm；流速：0.5 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣體積：20 μL；用于HPSEC法分離頭孢克洛中聚合物雜質。

1.4 柱切換-LC-MS法

1.4.1 一維色譜系統

方法同“1.3”高效凝膠排阻色譜（HPSEC）方法，進樣體積增加至40 μL。

1.4.2 二維色譜系統

色譜柱：Thermo Hypersil GOLD（C18，

2.1 mm×150 mm，5 μm）；流動相A：5 mmol/L醋酸銨溶液，流動相B：乙腈，梯度洗脫：0～（t+6） min （t為目標雜質在一維色譜系統的保留時間），5%B；（t+6）→（t+21） min，5%～95%B；（t+21）→（t+26） min，95%B；（t+22）→（t+27）min，5%B。切換閥：六通閥；切換用定量環體積：500 μL。用于對一維色譜系統分離的聚合物雜質進行脫鹽處理及質譜定性研究。

1.4.3 質譜條件

離子源：ESI；掃描電壓：3.8 kV；毛細管溫度： 320 ℃；鞘氣流速：40 mL/min；輔助氣流速：10 mL/min；一級質譜方法：正離子模式，分辨率70000，掃描范圍m/z 100～1500；二級質譜方法：分辨率17500，NCE：10，20，30。

1.5 強制聚合溶液配制

0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH8.0）：0.05 mol/L磷酸氫二鈉溶液-0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液（61：39），并用1 mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH值至8.0。

強制聚合溶液：精密稱取頭孢克洛約140 mg，置10 mL量瓶中，加0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH8.0）制成約含頭孢克洛14 mg/mL的溶液。室溫條件下避光放置4 d，精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。

2 結果

2.1 HPSEC法分析頭孢克洛原料中聚合物雜質

參照《中國藥典》2020年版頭孢地嗪鈉[11]有關物質Ⅱ檢查方法及文獻[9]，進行色譜條件的優化。建立的HPSEC法分析頭孢克洛強制聚合溶液，在頭孢克洛主峰之前分離出6個弱保留值雜質（圖2），即雜質1～6。

2.2 柱切換-LC/MS法推測頭孢克洛聚合物的化學結構

采用在線柱切換-LC/MS法將雜質1～6分別切入至定量環中，經脫鹽處理后，進行質譜分析。結果顯示，雜質5峰中包括4個共流出雜質峰，其他5個雜質峰中分別含有1個雜質峰。結合頭孢克洛結構性質、雜質的質譜信息及聚合機制，推斷質譜中分析出的9個雜質結構及來源，初步可推定其中6個聚合物雜質的結構，其他3個雜質結構及來源有待進一步研究。

2.2.1 已推定的聚合物雜質

雜質2經柱切換進入質譜后，可檢出雜質2-a（圖3A）。在雜質2-a的全掃描一級質譜圖中存在m/z 1397.21、m/z 1419.19的準分子離子峰，為[M+H]+、[M+Na]+峰，推測雜質2-a的分子量為1396 Da（圖3B）；其二級質譜圖中存在m/z 699.11的分子離子峰，應為聚合物雜質2-a的單體加氫離子（圖3B）；其可能結構及來源見圖3C。初步推測其聚合反應過程：頭孢克洛C-3位水解成羥基后，與另一分子頭孢克洛通過酰胺化聚合生成聚合物1或聚合物2；聚合物1、聚合物2的自身再聚合以及聚合物1和聚合物2之間的再聚合均可生成雜質2-a。聚合位點主要包括頭孢克洛、頭孢克洛C-3水解物7位側鏈的游離氨基和四元內酰胺環，理論上可形成多種異構體。

將雜質5切換至質譜可以檢出4個共流出的雜質峰（雜質5-a，雜質5-b，雜質5-c，雜質5-d）（圖4）。在雜質5-a的全掃描一級質譜圖中存在m/z 699.15準分子離子峰（[M+H]+）；其二級質譜圖中存在m/z 350.08的分子離子峰，應為聚合物雜質5-a的單體加氫離子；即雜質5-a的分子量應為698 Da。在其二級質譜圖中，存在羥基脫水碎片m/z 681.14 （m/z 699-18），脫羧基碎片m/z 655.12（m/z 699-44）。初步推測，此聚合物雜質系由頭孢克洛C-3位水解后自身聚合而成。其可能結構及來源見圖5A。

在雜質5-b的全掃描一級質譜圖中存在m/z

663.13、m/z 685.11的準分子離子峰，分別為[M+H]+、[M+Na]+峰；其二級質譜圖中存在

m/z 332.07的分子離子峰，應為聚合物雜質5-a的單體加氫離子；推測雜質5-b的分子量為662 Da。在其二級質譜圖中，脫羧基碎片m/z 619.15（m/z 663-44）。初步推測，頭孢克洛水解后經分子內酰胺化生成哌嗪類衍生物（即中間體1），再經分子內重排、脫水，生成吡嗪類衍生物（即中間體2），中間體2與其C-3位水解物（即中間體3）發生酰胺化反應生成雜質5-b。其結構及來源分析見圖5B。

在雜質5-c的全掃描一級質譜圖中存在

m/z 699.15、m/z 716.18的準分子離子峰，分別為[M+H]+、[M+NH4]+峰；且其二級質譜圖中存在m/z 350.08的分子離子峰，應為聚合物雜質5-c的單體加氫離子。即雜質5-c的分子量應為698 Da，初步推測其為聚合物雜質5-a的差向異構體。

在雜質5-d的全掃描一級質譜圖中存在m/z

735.09、m/z 757.07的準分子離子峰，分別為[M+H]+、[M+Na]+峰；其二級質譜圖中存在

m/z 368.05的分子離子峰，應為聚合物雜質5-d的單體加氫離子。即雜質5-d的分子量為734 Da，推測其應為頭孢克洛二聚物或頭孢克洛差向異構體二聚物，其結構及來源分析見圖5C。

將雜質6經柱切換進入質譜后可檢出雜質6-a（圖6）。在雜質6-a的全掃描一級質譜圖中存在m/z735.09、m/z 757.07的準分子離子峰，分別為[M+H]+、[M+Na]+峰；其二級質譜圖中存在m/z 368.05的分子離子峰，應為聚合物雜質6-a的單體加氫離子。即雜質6-a的分子量應為734 Da，與雜質5-d分子量相同。推測其為頭孢克洛二聚物或頭孢克洛差向異構體二聚物。

2.2.2 有待進一步研究的雜質

將雜質1經柱切換進入質譜后，可檢出雜質1-a（圖7A）。在雜質1-a的全掃描一級質譜圖中存在m/z 1030.17、m/z 1052.15的準分子離子峰，分別為[M+H]+、[M+Na]+峰，推測雜質1-a的分子量為1029 Da。1032峰、1034峰為1030峰的氯同位素峰， 1030峰、1032峰、1034峰豐度比為9：6：1，表示分子內含2個氯原子。但其具體結構有待進一步研究。

將雜質3經柱切換進入質譜后，可檢出雜質3-a（圖7B）。在雜質3-a的全掃描一級質譜圖中存在m/z 935.12準分子離子峰[M+H]+；其二級質譜圖中存在m/z 468.06的分子離子峰，應為聚合物雜質3-a的單體加氫離子。初步推測雜質3-a的分子量為934 Da，可能為頭孢克洛二聚體衍生物，其結構有待進一步研究。

將雜質4經柱切換進入質譜，可分析檢出雜質4-a（圖7C）。在雜質4-a的全掃描一級質譜圖中存在

m/z 879.13、 m/z 901.11的準分子離子峰，為[M+H]+、

[M+Na]+峰；其二級質譜圖中存在m/z 440.07的分子離子峰，應為聚合物雜質4-a的單體加氫離子。初步推測雜質4-a的分子量應為878 Da，可能為頭孢克洛二聚體衍生物，其結構有待進一步研究。

3 討論

由頭孢克洛的分子結構可知，其聚合反應途徑主要為C-7位側鏈的伯氨基與另一分子母核四元內酰胺環的羰基的反應[2]。本研究對頭孢克洛聚合物雜質的LC-MS分析揭示，其主要為頭孢克洛或頭孢克洛水解物按上述機理反應形成的二聚體或多聚體，與C-7位含有相似側鏈結構的頭孢氨芐、頭孢拉定等的聚合反應途徑相似。但由于頭孢克洛C-3位的氯基團較易水解成羥基，其水解物可能發生分子內酰胺化生成哌嗪類衍生物，再經分子內重排、脫水，生成吡嗪類衍生物參與聚合反應，又使得其與頭孢拉定、頭孢氨芐的聚合反應途徑的不同，表現出一定的復雜性，這可能是出現多個尚待進一步研究的雜質的原因。

本研究制備了頭孢克洛強制聚合反應溶液，采用HPSEC法進行分析，同時結合2D-HPLC、柱切換-LC/MS現代色譜分析技術，對頭孢克洛的聚合物雜質結構進行研究。結合頭孢克洛結構性質、雜質的質譜信息及頭孢菌素的聚合反應機制，對頭孢克洛聚合物雜質進行結構解析，并初步推測了其產生機制，為后續頭孢克洛聚合物的研究及抗生素中聚合物雜質的形成機理研究提供了參考。同時，對頭孢克洛原料及制劑的雜質譜研究、質量控制具有重要參考意義。

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