注射用頭孢西丁鈉有關物質測定方法的改進

王強?韓彬?王韻?楊天風?李聰穎?高燕霞

摘要：目的 改進注射用頭孢西丁鈉有關物質的測定方法。方法 采用苯基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Inertsil Ph-3色譜柱4.6 mm× 250 mm， 3 μm）；以甲酸銨緩沖液（取甲酸銨1.0 g，加水1000 mL使溶解，用甲酸調節pH值至2.7）為流動相A，乙腈為流動相B，按線性梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，檢測波長為254 nm。結果 頭孢西丁峰與各雜質峰分離良好，頭孢西丁在0.0446～13.3692 μg/mL范圍內線性良好，檢出限為0.89 ng，精密度與重復性均符合規定。結論 本方法靈敏度高，分離效果好，可現實對頭孢西丁鈉已知雜質和聚合物雜質進行同時檢測。

關鍵詞：注射用頭孢西丁鈉；有關物質；聚合物；方法優化；質量控制

中圖分類號：R978.1文獻標志碼：A

Improvement on the HPLC method for determination of related substances in cefoxitin sodium for injection

Abstract Objective This study improved the determination method of related substances in cefoxitin sodium for injection. Methods The column of phenyl silane-bonded silica gel as filler （Inertsil Ph-3， 4.6 mm×250 mm，3 μm） was used， and the mobile phase was composed of mobile phase A （1.0 g/L solution of ammonium formate adjusted to pH 2.7 with formic acid） and mobile phase B （acetonitrile） to carry out gradient elution. The flow rate was 1.0 mL/min. The column temperature was 35 ℃ and the detection wavelength was 254 nm. Results The peaks of cefoxitin sodium and its related substances were separated well. The linearity was good within the range of 0.0446～13.3692 μg/mL， and the limit of detection was 0.89 ng. Precision and repeatability met the requirements. Conclusion The method had the advantages of high sensitivity and good resolution， and could be used for the simultaneous detection of impurities and polymers.

Key words Cefoxitin sodium for injection; Related substances; Polymers; Method optimization; Quality control

頭孢西丁鈉（cefoxitin sodium）屬于第二代頭孢菌類藥物，由鏈霉菌產生的甲氧頭孢菌素C經半合成制得，對于革蘭陰性菌具有較強的抗菌作用。注射用頭孢西丁鈉由無菌原料直接分裝制成，無輔料添加。1974年由默沙東公司（Merck Sharp&Dohme）開發上市[1]，商品名美福仙（Mefoxin），1993年進入我國市場銷售。臨床主要用于敏感菌所致的呼吸道感染、心內膜炎和腹膜炎等感染，最主要的不良反應為皮疹等過敏反應[2]。

注射用頭孢西丁鈉收載于《中國藥典》2020年版[3]及美國藥典USP-NF2023版[4]。有關物質項下，《中國藥典》2020年版僅規定了最大單個雜質和總雜質的限度，未對已知雜質進行控制；USP中未設置有關物質檢測項。頭孢西丁鈉屬β-內酰胺類抗生素，易產生聚合物類雜質[5]，但各國藥典均尚未設置聚合物類雜質檢查項。對有關物質和聚合物類雜質的控制是保證抗生素類藥品安全性的重要環節，也一直是當前國內外藥品質量控制的熱點之一[6]。本文參照歐洲藥典（EP11.0）中頭孢西丁鈉原料有關物質HPLC檢查法，通過優化色譜條件，實現了對已知雜質和聚合物類雜質的同時檢測，為完善藥品質量標準提供了參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀（日本shimadzu公司），Thermo Scientific Orbitrap Exploris 120質譜儀（美國Thermofisher公司），Mettler TOLEDO XS205型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 試藥

頭孢西丁鈉對照品（批號130572-201603，95.1%）來自中國食品藥品檢定研究院；頭孢西丁峰鑒別對照品（批號Y0001496）為歐洲藥典（EP）對照品。乙腈為色譜純（德國Merck公司），其他試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 樣品

選擇原料分別來源于不同生產企業的3個廠家（分別以A、B、C表示） 的注射用頭孢西丁鈉，樣本基本可涵蓋目前國內的現狀。

2 方法

2.1 色譜條件

2.1.1 有關物質色譜條件

色譜柱：Inertsil Ph-3（4.6 mm×250 mm，3 μm）；流動相A：甲酸銨緩沖液（取甲酸銨1.0 g，加水1000 mL使溶解，用甲酸調節pH值至2.7）；流動相B：乙腈，柱溫為35 ℃；檢測波長為254 nm；進樣體積20 μL。按表1進行線性梯度洗脫。

2.1.2 雜質分析質譜條件

離子源：H-ESI；正離子噴霧電壓：3500 V；鞘氣流速：60 Arb；輔助氣流速：15 Arb；吹掃氣流速：2 Arb；離子傳輸管溫度：350 ℃；氣化溫度：350 ℃；掃描模式：Full MS；掃描范圍：100～1000 m/z。

2.2 溶液的配制

2.2.1 系統適用性溶液

取頭孢西丁鈉適量，精密稱定，用磷酸鹽緩沖液（稱取磷酸二氫鉀0.1 g和無水磷酸氫二鈉0.18 g，加水1000 mL使溶解，用磷酸或1 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至7.0）溶解并定量稀釋成每1 mL中約含0.1 g的溶液，室溫放置3 d。量取適量，用磷酸鹽緩沖液溶解并定量稀釋成每1 mL中約含1 mg的溶液。

2.2.2 供試品溶液

取樣品適量，精密稱定，加磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋制成約含1 mg/mL的溶液，搖勻。

2.2.3 對照溶液

精密量“2.2.2”項供試品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，加磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋至刻度。

2.3 方法驗證

按《中國藥典》2020年版通則9101分析方法驗證指導原則要求進行方法的驗證。

2.3.1 專屬性

（1）系統適用性

取“2.2.1”項下系統適用性溶液，依法測定，考察各雜質間分離度。

（2）強制降解實驗

取A廠家樣品制備6份供試品溶液，分別置不同的條件進行降解試驗，條件如下：①酸破壞：加0.1 mol/L鹽酸溶液2 mL，室溫放置5 min，再加1 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL中和；②堿破壞：加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL，室溫放置5 min，再加1 mol/L鹽酸溶液2 mL中和；③氧化破壞：加3%過氧化氫2 mL，室溫放置10 min；④熱破壞：70 ℃水浴加熱15 min；⑤光照破壞：在光照（照度為4500 Lx）下，連續照射72 h；⑥紫外破壞：紫外燈（365 nm）下6 h。

2.3.2 檢出限與定量限

取頭孢西丁對照品適量，加溶劑逐步稀釋制備溶液，分別精密量取20 ?L ，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，以信噪比（S/N）為3計算檢出限，以信噪比（S/N）為10計算定量限。

2.3.3 線性范圍

精密稱取頭孢西丁鈉對照品93.72 mg，置50 mL量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。精密量取儲備液1 mL置100 mL量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取0.05、0.25、0.5、2.5、5.0、10.0和15.0 mL置20 mL量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻。取上述溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，計算回歸方程及相關系數。

2.3.4 重復性

取B廠家樣品平行制備6份供試品溶液，依法測定各雜質含量，考察方法重復性。

2.3.5 進樣精密度

取“2.2.3”項下對照溶液，連續進樣6次，以峰面積計算RSD，考察精密度。

2.3.6 耐用性

根據“2.1.1”項下的色譜條件，分別考察不同流動相pH值（±0.05）、柱溫（±2 ℃）及不同批次色譜柱對系統適用性試驗的影響。

2.3.7 溶液穩定性

取A廠家樣品制備供試品溶液和對照品溶液。分別于0、4、8、10、12 h量取20 μL注入液相色譜儀（進樣室溫度4 ℃），記錄色譜圖。計算各已知雜質、總雜質的含量，以評價溶液的穩定性。

3 結果與討論

3.1 色譜柱的選擇

取不同品牌、規格的色譜柱進行實驗，發現Agilent Eclipse XDB-Phenyl（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Agilent Eclipse XDB-Phenyl（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）均無法有效分離主峰與雜質I（相對主峰約0.98處），而GL sciences Inertsil Ph-3（4.6 mm×250 mm，3 μm）可實現有效分離且分離效果最佳，因此選擇其作為本方法的適用色譜柱。

3.2 洗脫梯度的優化

在EP色譜條件下，結合LC-MS分析，發現色譜圖中50 min后有兩個聚合物雜質。相關文獻表明[7-9]，RP-HPLC色譜系統更強的專屬性。因而在原梯度的基礎上，通過增加流動相B的比例來縮短聚合物雜質的洗脫時間，并適當增加梯度完成后的平衡時間，實現對有關物質與聚合物類雜質的同時檢測。

3.3 方法驗證

3.3.1 系統適用性

在系統適用性實驗色譜圖中，雜質A、雜質I、頭孢西丁、雜質H、雜質E、雜質B、雜質J、聚合物1和聚合物2依次出峰（圖1），各色譜峰的相對保留時間分別約為0.83、0.98、1.00、1.04、1.11、1.18、1.69、1.74和1.95，各色譜峰之間均可實現完全分離。

3.3.2 強制降解實驗

在諸強制降解實驗（酸、堿、氧化、熱、光照、紫外破壞）中，頭孢西丁主峰及各雜質峰的分離度均可滿足要求（圖2），提示本方法的專屬性良好。

3.3.3 檢出限與定量限

本方法的檢測限為0.0446 ?g/mL（0.89 ng），定量限為0.1337 ?g/mL（2.68 ng），分別相當于供試品溶液的0.005%與0.015%，方法的靈敏度滿足有關物質檢測的要求。

3.3.4 線性范圍

本方法在濃度0.0446～13.3692 μg/mL范圍內線性良好。線性方程為Y=25354X+765.73（r=0.9999）。

3.3.5 重復性

相同樣品分別進行6次測定，雜質A結果為0.09%～0.10%（RSD 5.2%）、雜質I為0.40%～0.41%（RSD 1.0%）、雜質H為0.05%（RSD為0）、雜質E為0.11%（RSD為0），聚合物1為0.07%～0.08%（RSD 5.2%），雜質總和為1.17%～1.20%（RSD 0.9%），提示方法的重現性良好。

3.3.6 進樣精密度

取對照溶液，連續進樣6次，峰面積為231308～ 232419（RSD為0.2%），提示方法的精密度良好。

3.3.7 耐用性

實驗中色譜條件的細微波動對主峰和各雜質雖有微小的影響，但各峰間分離度均能滿足要求，主要已知雜質的相對保留時間變化較?。ū?），提示方法色譜條件的耐用性可滿足常規檢測的需要。

3.3.8 溶液穩定性

頭孢西丁鈉供試品溶液在4 ℃條件下穩定，各已知雜質、雜質總和變化不大，變化范圍均為0.01%。

3.4 雜質結構分析

采用LC-MS/MS對實際樣品中主要雜質的結構進行推測。雜質A、雜質I、雜質H、雜質E、雜質B及雜質J的結構在EP11.0中已經明確給出，LC-MS/MS推測結果與EP給出的結構相吻合（表3）。

對聚合物1（RRT=1.74）和聚合物2（RRT=1.95）的結構進行分析（表4）。聚合物1的一級質譜圖中m/z 870.1166為[M+NH4]+，分子量為852.0859，推測分子式為C32H32N6O14S4。二級質譜圖中主要的裂解碎片為m/z 731.0605、m/z 671.0345、m/z 587.0857、m/z

456.9945、m/z 218.9936（圖3）。聚合物2的一級質譜圖中分子離子峰m/z 750.1024為[M+H]+，767.1292為[M+NH4]+，分子量為749.0954，推測分子式為C30H31N5O10S4。二級質譜圖中主要的裂解碎片為m/z 712.0429、m/z 545.0053、m/z 501.0138和m/z 448.0057（圖4）。

3.5 樣品測定

取3個廠家的樣品分別進行檢測，計算雜質含量，結果表明各企業樣品存在一定差異，主要為雜質I，B企業樣品雜質I含量明顯高于其他兩家企業樣品，為0.40%，樣品檢驗結果見表5。

4 結論

本文優化的檢測注射用頭孢西丁鈉有關物質的高效液相色譜法，具有專屬性強、靈敏度高、操作簡單的特點，可準確測定頭孢西丁鈉有關物質及聚合物類雜質。與2020版《中國藥典》方法相比，改進后的方法對雜質的檢出更為全面，可作為現有藥品質量標準的有效補充。

參 考 文 獻

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