注射用頭孢唑肟鈉有關物質測定方法的建立

張秉華?王小亮?梁亞偉?席志芳?牛龍青

摘要：目的 建立注射用頭孢唑肟鈉有關物質HPLC分析方法并對國產樣品雜質情況行分析。方法 采用Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm）色譜柱，柱溫：35 ℃，流動相：以pH3.6乙酸銨溶液為流動相A，乙腈為流動相B，線性梯度洗脫：0→10 min，97%A→90 % A；10→20 min，90%A→80 % A；20→30 min，80%A；30→35 min，80%A→15 % A；35→45 min，15 % A；45→46 min，15%A→97%A，46→55 min，97%A；流速：0.8 mL/min，檢測波長：254 nm，進樣量：20 ?L。結果 酸、堿、氧化、高溫、光照強制降解試驗證明方法的專屬性良好；頭孢唑肟及頭孢唑肟諸分別在0.75～4.5 μg/mL濃度范圍內線性關系良好；頭孢唑肟及10種已知雜質（雜質18、開環脫羧S-氧化物1、開環脫羧S-氧化物2、雜質KTO、雜質16、雜質6、雜質3、雜質13、二聚體及雜質12）的定量限分別為1.63、6.30、2.78、2.84、2.31、7.86、3.06、1.62、1.90、3.87和3.09 ng；各已知雜質平均回收率均在“96.5%～101.6%”之間；重復性RSD均符合要求。結論 所建立的方法專屬性、準確性及耐用性均良好，可用于注射用頭孢唑肟鈉有關物質的檢測。

關鍵詞：頭孢唑肟鈉；有關物質；高效液相；雜質檢測

中圖分類號：R917文獻標志碼：A

Establishment of an HPLC method for determination of related substance of cefazoxime sodium for injection

Abstract Objective This study constructed an HPLC method for the determination of the related substance cefazoxime sodium for injection and analyzed the impurities in domestic products. Methods The HPLC analysis was performed on an Agilent Zorbax SB-C18 column（250 mm×4.6 mm， 5μm） with the column temperature at 35 oC. The mobile phase A was the pH 3.6 ammonium acetate solution， and the mobile phase B was acetonitrile. Gradient elution was performed as follows： 0→10 min， 97%A→90%A; 10→20 min， 90%A→80%A; 20→30 min， 80%A; 30→35 min， 80%A→15%A; 35→45 min， 15% A; 45→46min， 15%A→97%A; 46→55min， 97%A. The flow rate was 0.8 mL/min. The detection wavelength was 254 nm. The injection volume was 20 ?L. Results The acid， alkali， oxidation， high temperature， and light-forced degradation tests demonstrated good specificity of the methods. The linear range of cefzoloxime and cefazoxime was found to be between 0.75～4.5 μg/mL with a good linear relationship. The quantification limits of cefotaxime and 10 of the known impurities （impurity 18， open ring decarboxylated S-oxide1， open ring decarboxylated S-oxide2， impurity KTO， cefzoloxime open ring， impurity D， impurity 3， cefzoloxime E isomer， dimer and impurity 12） were 1.63， 6.30， 2.78， 2.84， 2.31， 7.86， 3.06， 1.62， 1.90， 3.87 and 3.09 ng， respectively. The average recoveries of all known impurities were between 96.5% and 101.6%. The RSD of repeatability all met the requirements. Conclusion The method proved to be specific， accurate and rugged， which made it suitable for the related substance analysis of cefazoxime sodium for injection. It could be used for the control of cefazoxime sodium for injection in the domestic market.

Key words HPLC; Related substance; Impurity profile; Cefazoxime sodium

注射用頭孢唑肟鈉為頭孢唑肟鈉無菌原料直接分裝制成的注射劑，適用于對頭孢唑肟敏感的鏈球菌屬、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、大腸埃希菌、克雷伯菌屬、變形桿菌屬、沙雷菌屬等引起的感染，臨床應用廣泛[1]。新冠肺炎時期，臨床應用亦較多[2-3]。

頭孢唑肟鈉由7-氨基-氫頭孢烷酸（7-ANCA）與AE活性酯或DNMA活性酯合成，其雜質主要由合成工藝與降解途徑引入[4]?！吨袊幍洹?020年版注射用頭孢唑肟鈉采用HPLC法對其有關物質進行控制，頭孢唑肟二聚體限度為不得過0.1%，其他單個雜質不得過0.5%，雜質總量不得過1.0%[5]。企業的穩定性資料表明，產品中的雜質量隨儲藏時間而增加；各生產企業的實際應用中發現藥典方法不能準確地分離、檢測工藝雜質和降解雜質；因而，一些企業申報了各自的企業標準，采用不同的有關物質檢測方法控制自己產品的質量，提示《中國藥典》2020 年版注射用頭孢唑肟鈉有關物質HPLC測定法需進一步地優化。

2023年注射用頭孢唑肟鈉列入國家藥品抽檢計劃，抽驗樣品涵蓋28個生產企業，涉及8個不同的有關物質檢查方法。按照現行藥品質量控制理念，參照相關文獻[6-8]。本文嘗試對《中國藥典》2020年版注射用頭孢唑肟鈉有關物質HPLC測定方法進行優化，通過對其流動相緩沖鹽種類、梯度洗脫程序、柱溫等參數的調整，建立新的HPLC方法，以滿足對不同企業產品質量控制的需要。

1 儀器及試藥

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（島津LC-2030 3D），紫外檢測器（島津DAD），恒溫水浴鍋（德國Haake），電子分析天平（瑞士Mettler Toledo官方XPE205），高純水機（美國Millipore公司）。

乙腈（色譜純，Sigma公司），乙酸銨（分析純，國藥試劑），高純水（實驗室自制）。

1.2 試藥

頭孢唑肟對照品（130504-202304），含量為97.8%，購自中國食品藥品檢定研究院；雜質D（QRTBZWX023-20220729），含量為98.58%，頭孢唑肟開環物（QRTBZWX017-20220902）購自廣州清瑞生物科技有限責任公司；頭孢唑肟E異構體（20230201），來自Molcoo Chemicals Inc.；雜質3、雜質6、雜質12、雜質13、雜質16、雜質18、雜質KTO、二聚體及其異構體、開環脫羧S-氧化物1和開環脫羧-S氧化物2對照品均為西南藥業股份有限公司提供；2-巰基苯并噻唑對照品（G1211642），含量為98.45%，購自Ehrenstorferf公司。

1.3 樣品

76批注射用頭孢唑肟鈉均為2023年國家藥品評價性抽驗樣品，涉及28個生產企業6個規格（0.25、0.5、0.75、1.0、1.5和2.0 g）的產品。頭孢唑肟原料為企業提供。

2 方法

2.1 色譜條件

采用Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；以 pH 3.6的50 mmol/L的乙酸銨溶液為流動相A，乙腈為流動相B，按表1方式進行梯度洗脫；流速為0.8 mL/min；柱溫：35℃；檢測波長為254 nm；進樣體積：20 μL。樣品臨用新制。

2.2 樣品制備

2.2.1 系統適用性溶液的制備

取頭孢唑肟雜質18、開環脫羧S-氧化物1、開環脫羧S-氧化物2、雜質KTO、頭孢唑肟開環物、雜質D、雜質3、頭孢唑肟E異構體、二聚體及雜質12雜質對照品各約5 mg，分別至50 mL量瓶中，作為雜質儲備液。取頭孢唑肟鈉原料150 mg，再分別取上述雜質儲備液3 mL至100 mL量瓶中，得頭孢唑肟鈉1.5 mg/mL，各雜質3 μg/mL的溶液，作為系統適用性溶液。

2.2.2 對照品溶液的制備

取頭孢唑肟對照品適量，精密稱定，加pH7.0的磷酸緩沖液溶解并定量稀釋制成每1 mL中含頭孢唑肟3 μg的溶液作為對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

臨用新制。取本品適量（約含頭孢唑肟75 mg），精密稱定，置50 mL量瓶中，用pH7.0磷酸鹽緩沖液溶解并定量制成每1 mL中約含頭孢唑肟1.5 mg的溶液。

2.3 測定法

精密量取空白溶液、系統適應性溶液、對照品溶液及供試品溶液各20 ?L注入液相色譜儀，記錄色譜圖；采用主成分外標法以峰面積計算產品中已知雜質和未知雜質的含量。

2.4 方法驗證

參考《中國藥典》2020年版四部9101分析方法驗證指導原則，對方法的專屬性、線性和范圍、準確度、檢測限、定量限、精密度、耐用性以及溶液穩定性進行驗證。

2.4.1 專屬性

（1）未破壞溶液的制備? ? 取本品約75 mg（以頭孢唑肟計），用pH7.0緩沖液溶解并稀釋至50 mL，作為供試品溶液A。

（2）強酸破壞溶液的制備? ? 取本品約75 mg，加鹽酸10滴，放置30 min，用1 mol/L氫氧化鈉調節pH至中性，以 pH7.0緩沖液稀釋至50 mL，作為供試品溶液B。

（3）強堿破壞溶液的制備? ? 取本品約75 mg，加 5 mol/L氫氧化鈉10滴，放置30 min，用1 mol/L 鹽酸調節pH至中性，以pH7.0緩沖液稀釋至50 mL，作為供試品溶液C。

（4）氧化破壞溶液的制備? ? 取本品約75 mg，加雙氧水1滴，水10 mL，放置30 min，以 pH7.0緩沖液稀釋至50 mL，作為供試品溶液D。

（5）高溫破壞溶液的制備? ? 取本品約75 mg，以 pH7.0緩沖液稀釋至50 mL，置100℃水浴中放置1 h，作為供試品溶液E。

（6）光破壞溶液的制備? ? 取本品，置5000 Lx照度下放置2 d，取約75 mg，以 pH7.0緩沖液稀釋至50 mL，作為供試品溶液F。

分別取上述強制降解試驗溶液（A～F）20 ?L，進行專屬性驗證。

2.4.2 線性與范圍

精密稱取頭孢唑肟、頭孢唑肟雜質18、開環脫羧S-氧化物1、開環脫羧S-氧化物2、雜質KTO、頭孢唑肟開環物、雜質D、雜質3、頭孢唑肟E異構體、二聚體及雜質12對照品適量，稀釋制成濃度分別為0.75、1.2、1.8、3.0、3.6和4.5 μg/mL的系列濃度溶液，分別進樣；對峰面積（Y）和進樣量（X）進行線性回歸分析。

2.4.3 準確性

選取雜質含量已知的企業A（編號1）樣品，進行加樣回收率實驗。首先制備每毫升分別含頭孢唑肟鈉雜質18（1.21 μg）、開環脫羧S-氧化物1（1.22 μg）、開環脫羧S-氧化物2（1.19 μg）、雜質KTO（1.18 μg）、雜質16（1.31 μg）、雜質6（1.27 μg）、雜質3（1.09 μg）、雜質13（1.15 μg）、二聚體（1.23 μg）、雜質12（1.03 μg）的諸雜質混合雜質儲備液。精密稱取約含頭孢唑肟75 mg的企業A的樣品9份，分別置50 mL量瓶中，再分別加入混合雜質儲備液（0.9，0.9，0.9，1.5，1.5，1.5，2.25，2.25和2.25 mL），用pH7.0磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，即得。

2.4.4 LOD和LOQ

分別采用頭孢唑肟、雜質C、雜質D和雜質E的線性（1）溶液（0.75 ?g/mL），逐步稀釋測定，以S/N=3時的濃度作為檢測限，以S/N=10時的濃度作為定量限。

2.4.5 重復性

取某廠家同一批樣品，按“2.2.3”方法分別制備6份供試品溶液，測定其雜質的量，通過6份樣品測定結果的差異，評價方法的重復性。

2.4.6 溶液穩定性

供試品溶液在室溫放置0、1、2、4、6和8 h，分別測定頭孢唑肟、最大單個雜質（頭孢唑肟開環物）、二聚體及總雜質含量的變化，評價供試品溶液室溫放置的穩定性。

3 結果與討論

3.1 新HPLC方法與藥典方法的比較

通過對檢驗中涉及的8個不同有關物質分析方法的比較，以諸雜質的分離情況為指針，對《中國藥典》有關物質分析方法中的流動相（由檸檬酸、磷酸二氫鈉緩沖鹽體系改進為乙酸銨緩沖鹽體系）和梯度洗脫程序（梯度時間由30 min改為55 min）和柱溫（40 ℃柱溫改為35 ℃）進行了優化。藥典方法系統適用性典型色譜圖見圖2，當藥典方法滿足其系統適用性試驗的要求時，進樣優化方法的系統適用性溶液（圖3a）可見，藥典色譜系統僅能分離出其中的7種已知雜質（頭孢唑肟雜質18、開環脫羧S-氧化物1、開環脫羧S-氧化物2和雜質KTO、雜質16、雜質6和二聚體），且雜質18與溶劑峰的倒峰分離較為困難，雜質16的峰形較差；而改進后的色譜方法對諸雜質的分離良好（圖3b），且各雜質峰的峰形亦較理想。提示優化后的方法明顯優于原藥典方法，可滿足對不同企業產品質量控制的需要。

3.2 方法學驗證

3.2.1 專屬性

對諸強制降解溶液進行分析（圖4），強制降解試驗產生的雜質種類和雜質量的變化見表2。強制降解溶液中的各雜質峰均能達到有效要求，表明新方法的專屬性良好，可有效分離頭孢唑肟的主成分及各種降解雜質。由表2同時可以看出與，酸破壞對樣品的穩定性影響最小，僅雜質18和雜質12略有增長；堿破壞對雜質的種類和量均有較大影響，雜質16和雜質3增長最多，同時產生了新的未知雜質；高溫降解主要產生雜質18和雜質3；氧化破壞主要產生雜質開環脫羧S-氧化物1和開環脫羧S-氧化物2；光破壞，雜質18和雜質6略有增加。即頭孢唑肟鈉溶液在堿性、高溫及氧化條件下極不穩定。

3.2.2 線性和范圍

頭孢唑肟的線性方程為：Y=57824X+13072，r為1.000；雜質18為：Y=41930X-3664，r為0.999；開環脫羧S-氧化物1為：Y=28876X+85，r為1.000；開環脫羧S-氧化物2為：Y=34236X-1881，r為1.000；雜質KTO為Y=17118X-941，r為1.000；頭孢唑肟開環物線性方程為：Y=19059X-6566，r為1.000；雜質D為：Y=39948X-1065，r為1.000；雜質3線性方程為：Y=60879X-357，r為1.000；頭孢唑肟E異構體為：Y=43105X+10960，r為1.000；二聚體為：Y=23456X+7602，r為1.000；雜質12為：Y=55387X-1417，r為1.000。結果表明：頭孢唑肟鈉及其10種已知雜質均在0.75～4.5 μg/mL范圍內線性關系良好。

3.2.3 準確性

頭孢唑肟鈉雜質18、開環脫羧S-氧化物1、開環脫羧S-氧化物2、雜質KTO、雜質16、雜質6、雜質3、雜質13、二聚體及雜質12的加樣回收率分別為99.4%、97.4%、96.9%、99.6%、101.6%、98.6%、96.5%、97.9%和100.8%。

單個雜質在藥典標準中限度要求為0.5%，二聚體為0.1%?！吨袊幍洹?020年版四部9101藥品分析方法驗證指導原則[9]中規定：樣品中待測成分含量為0.1%時，回收率限度要求為90%～108%。各已知雜質平均回收率范圍為“96.5%～101.6%”，均符合藥典要求，表明新方法的準確度良好。

3.2.4 LOD和LOQ

頭孢唑肟及10種已知雜質（頭孢唑肟鈉雜質18、開環脫羧S-氧化物1、開環脫羧S-氧化物2、雜質KTO、雜質16、雜質6、雜質3、雜質13、二聚體及雜質12）的檢出限分別為0.82、1.26、1.39、1.42、1.16、3.93、1.53、0.81、0.98、1.96及1.54 ng；定量限分別為1.63、6.30、2.78、2.84、2.31、7.86、3.06、1.62、1.90、3.87及3.09 ng。

3.2.5 重復性

取某廠家同一批號6份樣品進行測定，雜質測定結果分別為頭孢唑肟鈉雜質18未檢出、開環脫羧S-氧化物1未檢出、開環脫羧S-氧化物2及雜質KTO未檢出、雜質16檢出0.19%（RSD6.6%）、雜質6檢出0.14%（RSD10.4%）、雜質3未檢出、雜質13未檢出、二聚體及其異構體檢出0.11%（RSD6.8%）雜質12未檢出，其他未知最大雜質檢出0.18%（RSD8.6%）、總雜質檢出0.22%（RSD8.4%），RSD均符合要求，表明新方法重復性良好。

3.2.6 溶液穩定性

供試品溶液在室溫隨著放置時間的延長，頭孢唑肟含量變化不顯著，RSD為0.28%；二聚體稍有增多；頭孢唑肟開環物及總雜質明顯增大，6 h后超出限度范圍，頭孢唑肟開環物由最初的0.14%增長至0.48%，總雜質由最初的0.15%增長至0.49%，RSD分別為48.8%和46.8%。即注射用頭孢唑肟鈉溶液室溫下穩定性較差，建議臨用新制。

3.2.7 耐用性

采用C18色譜柱（Waters Symmetry Shield RP18? 250 mm×4.6 mm， 5 μm）替代Agilent ZORBAX SB-C18，同時改變流動相的流速（0.7和0.9 mL/min）和柱溫（30和40 ℃），以及流動相中色譜純乙腈的品牌頭孢唑肟鈉及各已知、未知雜質均可有效分離。

3.3 樣品測定

通過對28家企業76批樣品的測定結果進行分析，典型色譜圖見圖5，發現各生產企業樣品檢出的雜質種類和數量均比藥典多和高。

28家生產企業中，參比企業“西南藥業”樣品中雜質16的檢出量約為0.17%；“山東X企業、東北X企業及珠海X企業”3個企業檢出的雜質16相對較大，范圍約在0.33%～0.43%之間；“重慶、?？?、上海、蘇州、河北及汕頭等”7個企業雜質16檢出較小，范圍約在0.15%～0.20%之間，基本與參比制劑一致；其余17個生產企業雜質16的檢出范圍約在0.20%～0.30%之間。

28家生產企業中，參比企業“西南藥業”樣品中總雜質的檢出量約為0.23%；“山東X企業、東北X企業及珠海X企業”3個企業檢出的總雜質相對較大，范圍約在0.43%～0.58%之間；“重慶、?？?、上海、蘇州、河北及汕頭等”7個企業總雜質檢出較小，范圍約在0.20%～0.26%之間，基本與參比制劑一致；其余17個生產企業總雜質檢出范圍約在0.30%～0.40%之間。

二聚體及其異構體的檢出量主要分布區域為0.005%～0.018%的區域，遠小于限度0.10%，且各企業之間檢出量無明顯差異，基本與參比企業一致。

4 結論

本文所建立的注射用頭孢唑肟鈉有關物質方法可滿足對不同企業產品質量控制的需要。在注射用頭孢唑肟鈉中可檢出10余種雜質，但主要雜質（超過0.1%）為雜質16（頭孢唑肟開環物），將其作為特定雜質控制具有重要意義；同時，二聚體體現了產品中聚合物的水平，具有重要的控制意義。根據對實際樣品的考察結果，雜質16、二聚體及總雜質分別分布在0.2%，0.02%和0.3%左右，可據此制定雜質的限度。

參 考 文 獻

鄭潔， 隆莉， 袁帥. 臨床常用抗菌藥治療肺炎克雷伯菌感染的臨床療效[J]. 國外醫藥（抗生素分冊）， 2021， 42（5）： 286-289.

施毅， 蘇欣， 肖永營， 等. 注射用頭孢唑肟鈉治療細菌性感染的多中心隨機對照臨床研究[J]. 中國抗感染化療雜志， 2005， 5（6）： 350-354.

戎霞君， 陳巍， 黃紹光. 注射用頭孢唑肟鈉治療下呼吸道細菌感染的研究[J]. 世界臨床藥物， 2006， 27（7）： 395-400.

黃美英， 夏星， 羅凱， 等. 頭孢唑肟鈉生產工藝及條件的研究[J]. 中國藥房， 2007， 18（22）： 1695-1697.

國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典[S]. （2020年版二部）. 中國醫藥科技出版社， 2020： 342-344.

楊倩， 李偉， 曹曉云， 等. 注射用頭孢唑肟鈉的雜質譜研究[J]. 中國藥學雜志， 2014， 49（19）： 1750-1754.

孟君， 林順權， 蒲含林， 等. 頭孢唑肟鈉有關物質的研究（英文）[J]. 中國抗生素雜志， 2022， 47（7）： 682-690.

于佳， 張一竹， 李委佳， 等. 頭孢唑肟鈉混合降解雜質對照物的研究與應用[J]. 化學工程師， 2018， 32（2）： 8-10.

國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典[S]. （2020年版四部）. 中國醫藥科技出版社， 2020： 480-483.