納米顆粒介導冷凍消融治療腫瘤的研究進展

王輔明， 楊繼金

冷凍消融術是一種常見的腫瘤微創治療方式，具有手術操作簡單，花費較少，術后恢復快等優勢，對于一些中晚期腫瘤患者還可以聯合其他治療手段實現綜合治療［1-3］。冷凍消融術發展至今仍然存在腫瘤細胞殺滅不徹底、復發率高、可能損傷周圍正常組織以及具有爭議性的安全消融邊緣等問題。 如何盡可能殺死消融區域內的腫瘤細胞，又盡量減少損傷周圍正常組織，是冷凍消融術進一步發展亟待突破的難點。 隨著納米科學的迅猛發展，大量研究表明將特異性的納米顆粒通過不同方式加載到消融靶區，可以顯著提高該冷凍效率或保護周圍正常組織，通過調整納米顆粒的分布和濃度，可以實現操縱消融區域的形狀以確?？梢酝耆谀[瘤，同時實現靶向投遞各種藥物，增強顯像能力等。 本文主要回顧幾種常見的應用于介導冷凍消融術的納米顆粒及主要作用機制，有助于更加全面地了解這種治療模式，為以后的實驗研究以及再下一步實現臨床轉化打牢基礎。

1 納米顆粒介導冷凍消融的主要作用機制

中國科學院理化技術研究所低溫生物醫學實驗室于2004 年率先提出了納米冷凍手術這個概念，并一直致力于相關納米材料的開發研究［4］。介導冷凍消融的納米材料按照基質類型大致可分為4大類：金屬、有機物、液態金屬和復合材料。 主要作用原理為向目標區域加載不同功能的納米顆粒，實現以下幾個目的：①提升冷凍效率，擴大有效消融范圍，保護周圍健康組織；②負載各種藥物，靶向投遞到目標區域，聯合其他治療手段；③充當圖形增敏劑，提高消融過程中圖像的精準度。 主要作用機制為：

1.1 促進細胞內外冰晶的形成，改變滲透性

冷凍消融治療過程中細胞內外冰晶的形成可以誘導細胞脫水、蛋白質變性和脂質相變從而殺死活細胞［5-6］。在冷凍過程中臨界冰核是冰晶形成的關鍵初始步驟，Bai 等［7］的實驗研究認為，小于臨界冰核（8 nm）的氧化石墨烯納米材料抑制冰晶的形成，而大于臨界冰核（11 nm）的氧化石墨烯納米片則促進冰晶的生長。 因此納米顆粒的尺寸大小對冰晶的生長速率具有重要意義，同時還需要考慮納米顆粒的表面積， 這和納米顆粒的熱傳遞能力直接相關，金屬納米顆粒通常會比其他類型的納米材料熱導率更高。 納米顆粒由于EPR 效應（實體瘤的高通透性和滯留效應）而聚集在腫瘤組織周圍并進入細胞，可以有效增加細胞內冰晶形成的效率。 金、銀、氧化鎂以及四氧化三鐵等納米顆粒均可以通過充當冰結晶的核來提高細胞內、外冰晶的形成速率，另外四氧化三鐵納米顆粒在冷熱循環后， 除了可以增加冰晶的形成還能明顯提高細胞脫水的發生率［8-9］。不同的金屬納米材質、尺寸、形狀都會影響冷凍效率的改變。 利用這些納米顆粒增強冰晶生長的能力，同時配合應用具有低熱傳遞效率的聚合物或脂質納米顆粒（例如相變材料），或者具有低溫保護作用的二甲基亞砜的水懸浮液，可以實現操縱冰球的生成形狀，可以完全覆蓋不規則形狀的腫瘤，同時最大限度保護周圍正常健康組織［10-12］。 冰晶的形成和生成形狀跟納米材料表面的官能團也有關系，官能團的位置不同，納米顆粒既可以表現為增強也可以表現為抑制冰晶的生長，當細胞內形成鋒利的冰晶可以直接損傷細胞器和細胞膜，有利于提高冷凍效率。 殼聚糖修飾的纖維素納米材料（CS-CNC）對比其他納米顆粒表現出更高的冷凍性能，就是因為其促進細胞內形成了細長銳利的冰晶［13］。 冷凍過程中細胞是否發生壞死和冰結晶過程中細胞膜的流動性和滲透性密切相關，當細胞內外結晶時，細胞膜的滲透梯度失去平衡而出現致死性的脫水［14］。 在細胞中普遍存在一種水通道蛋白，可以一定程度平衡細胞滲透性的改變，當體內細胞遭遇低溫時會形成更多的水通道蛋白，以適應細胞低溫過程中滲透性的改變。 很多癌細胞都存在水通道蛋白，水通道蛋白過度表達也被認為是腫瘤不良預后的指標之一。 因此一些納米材料具有水通道蛋白抑制劑的功能，可以有效的輔助冷凍消融手術，增強冷凍消融的效率［15］。 另外一些特定尺寸和電荷的納米顆?？梢酝ㄟ^物理結合吸附在細胞膜上從而改變膜的性能，改變其流動性和滲透性，從而增加細胞對低溫的敏感性。 納米顆粒本身的親水性或者疏水性也可以直接影響細胞膜的滲透性，比如兩親性的金納米顆粒能夠嵌入腫瘤細胞脂質雙層內并直接影響膜局部滲透性［16-17］。

1.2 負載其他藥物，實現綜合治療

基于納米顆?？尚揎椀奶匦?，可以設計各種納米顆粒負載各種藥物進行靶向遞送，使得目標區域達到有效藥物濃度，完成治療目的同時避免出現全身不良反應。Goel 等［18］的研究認為通過用TNF-α 和硫醇衍生的聚乙二醇標記的金納米顆粒選擇性地將TNF-α 遞送至腫瘤，可以顯著提高冰球內細胞致死溫度的閾值，幾乎可以完全殺死冰球范圍內的腫瘤細胞，也減少了TNF-α 的全身毒性作用。 針對腫瘤干細胞樣細胞的化學耐藥性，饒偉團隊研究負載有阿霉素的gnDOX 納米顆粒， 冷凍消融過程中低溫響應確保了藥物的緩釋，展示了克服腫瘤干細胞樣細胞的化學耐藥性，顯著提高乳腺癌整體治療效率的強大潛力［19］。Wang 等［20］合成的HCPN-CG 低溫響應納米顆粒負載化療藥物伊立替康和光熱劑吲哚菁綠，在低于12℃的環境下釋放伊立替康，光熱劑吲哚菁綠在近紅外激光照射下實現復溫， 該研究模擬冷凍消融的凍融過程， 實驗表明在體內外均能顯著抑制乳腺癌細胞生長。新型納米材料，比如具有相變特性的液態金屬（例如熔點約為29.8℃的鎵），低溫時液態到固態的相變過程增加導熱性，而且鎵納米顆粒尖銳的突起可以直接刺破腫瘤細胞，利用液態金屬平臺建立“冰”（冷凍消融）和“火”（光熱療法）的雙重無創療法，針對黑色素瘤治療取得重大研究進展［21］。 由于冷凍消融是一種基于低溫的消融手段，更有可能保留抗原的蛋白質結構并激活全身免疫效應，這已經是臨床醫師達成的共識［22-25］。 最近的研究還發現一些帶有各種官能團（例如羧基、羥基或胺等）的納米材料，可以從消融的腫瘤細胞中捕獲腫瘤相關抗原和DAMPs（損傷相關的分子模式），并遞送到抗原呈遞細胞進而到達淋巴結激活T 細胞［22，26-28］。 如何將冷凍消融與免疫治療有效聯合，一直是臨床研究冷凍消融術的熱點，而通過納米顆粒實現聯合免疫治療的相關研究目前幾乎沒有。

1.3 增強顯像功能，實現多模態成像

納米技術很早就被應用于醫學影像學領域，圖像顯示更加清晰，支持三維動態成像的同時可以充分獲得目標組織的功能影像［29］。 氧化鐵納米顆粒具有光學、磁性、聲學和結構特性，早已作為圖像增敏劑被應用于MRI［30-31］。 納米顆粒因為EPR 效應停留在腫瘤區域，有著相較于其他小分子造影劑半衰期更長的優勢。 在冷凍消融治療過程中，能否清晰看到腫瘤邊緣對于實現完全消融至關重要。 金屬納米顆粒除了具有調節冷凍效率的功能，在臨床應用中還被廣泛研究作為CT 成像的造影劑［22，32-35］，其他非金屬類型的納米顆粒則可以通過負載造影劑（例如釓、碘油）來增強顯像能力。 除了傳統的影像成像方式之外，非傳統的成像方式，例如NIR（近紅外光）、熒光成像或使用金納米顆粒的表面增強拉曼散射，目前被認為也是可行的，而且具有更好的時空分辨率、靈敏度和信號特異性。 一些復合的納米顆粒還可以表現出多模態的顯像增強， 雙金屬納米顆粒（例如氧化鐵- 金納米顆粒）可以同時增強MRI 和CT 的顯像功能，負載釓和黑色素的二氧化硅納米顆?？梢酝瑫r實現增強MRI 和熒光成像［36］。另外納米顆?？梢酝ㄟ^配體修飾， 目前研究普遍采用葉酸、轉鐵蛋白、表皮生長因子受體（EGFR）和糖蛋白從而獲得特異性的靶向結合特定腫瘤細胞的能力［37］。殼聚糖修飾的纖維素納米顆粒（CS-CNC），具有特異性結合CD44 抗原的能力， 研究表明可以明顯增強對于CD44 抗原高表達的腫瘤細胞的冷凍效率［13］。目前大量復合功能的納米顆粒不斷在被研究開發應用到冷凍治療中，既可以增強冷凍效率，又能提高成像能力，這對于實現腫瘤的完全消融，尤其對于特殊位置的病灶尤為重要［38-39］。

2 小結與展望

當前的研究表明，納米顆粒介導冷凍消融的治療模式已經取得了一定的進展，但是仍然處于初級階段，普遍停留在體外細胞實驗、動物模型實驗等，鮮有相關的臨床試驗研究報道。 制約這種手術模式實現臨床轉化的主要原因在于：①這些納米顆粒的加載方式一般為直接穿刺或者靜脈注射，腫瘤周圍豐富的血供必然會帶走部分納米顆粒，納米顆粒靶向結合腫瘤細胞能力目前也不盡如人意，因此在目標區域內納米顆粒很難形成滿意的分布濃度和精準度；②使用納米顆粒后的增益效果缺乏詳盡的機制研究，大量實驗研究結果均表現出納米顆粒帶來的明確增益效果，但是普遍缺乏詳盡的機制層面的研究，主要關注的是納米顆粒介導的降溫速率或者細胞致死溫度閾值的變化，對于納米顆粒本身直接影響細胞、組織的機制研究不夠；③納米顆粒的生物相容性以及毒性仍然不確定，納米顆粒能否投入臨床應用首先需要考慮生物相容性和毒性問題，對于一些金屬為基質的納米顆粒，過量金屬離子長期滯留機體可能會帶來潛在風險。 最新生物可降解納米材料氧化鎂和天然纖維素納米顆粒的出現在一定程度上解決了生物相容性和毒性的問題，進一步研究有望在下一步可以嘗試推向臨床試驗。

基于納米材料的設計和合成構建的腫瘤靶向診療一體化納米平臺，是當前乃至未來一段時間腫瘤治療領域的研究熱點。 冷凍消融術是一種依賴精準的影像引導的局部治療手段，通過多功能的納米材料可以完美融入腫瘤診療一體化體系，多模態成像有助于準確顯示腫瘤邊緣幫助實現完全消融，同時可以聯合光熱療法、光動力療法、磁熱療法、化學藥物療法等實現綜合治療。 多種成像模式的相互補充，多種治療手段的相互聯合，最大程度發揮各自優勢，彌補劣勢，從而實現有效精準治療腫瘤的目的。

隨著納米科學的迅猛發展，各種新型多功能的納米顆粒層出不窮，如何更好地應用于介導冷凍消融，需要我們繼續致力于提高納米顆粒腫瘤靶向性和示蹤性的研究，提高特異性結合腫瘤細胞的能力是納米顆粒發揮其效能的保證，而示蹤性不僅僅局限于傳統影像學圖像的增強，可以更多研究聯合熒光、近紅外光成像等其他成像模式，更進一步在未來可以嘗試融合AI 識別， 實現智能規劃冷凍針的穿刺路徑和置針方案。 另外，構建能準確模擬人體不同器官結構和組織成分的體外模型，對于驗證納米顆粒的效能至關重要，是基礎實驗研究到臨床試驗最后實現臨床轉化的橋梁，這也是我們下一步實驗研究需要積極努力突破的課題之一。

綜上所述，納米顆粒介導冷凍消融作為一門跨學科領域，如何能夠將這種治療模式真正實現應用于臨床，突破冷凍治療的應用瓶頸，需要多個學科領域的共同努力。 隨著研究的不斷深入，相信在不遠的未來一定會給腫瘤治療帶來新的希望。