長鏈非編碼RNA 在原發性腎小球腎炎的研究進展

趙元梅 ,胡文剛 ,譚小紅 ,張娥 ,杜靜

陸軍軍醫大學第二附屬醫院1腎內科,2泌尿外科 重慶市,400037

原發性腎小球腎炎是一組以大量蛋白尿以及高脂血癥為主要臨床特征的腎臟疾病綜合征[1],主要包括微小病變腎病、系膜毛細血管性腎炎、IgA腎病、局灶節段性腎小球硬化癥、膜性腎病等病理類型,其中大量蛋白尿為該病的核心特征,腎小球濾過屏障最外層的足細胞損傷在原發性腎小球腎炎蛋白尿的發展中起著關鍵作用[2]。高脂血癥是該病的另一個重要特征,通常出現在疾病的急性期,并在病情緩解期消失,脂蛋白合成增強及代謝降低被認為是導致原發性腎小球腎炎高脂血癥的潛在機制[3]。但該病的具體發病機制尚不清楚。長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA,lncRNA) 是一種非編碼的調控RNA,在許多細胞機制中發揮核心作用,包括調節細胞過程[4],還可通過基因印跡、組蛋白修飾、染色質重塑和其他機制調節病理生理過程[5]。越來越多的學者報道了lncRNA 與原發性腎小球腎炎之間的關系,其異常表達在原發性腎小球腎炎發生發展過程中起著至關重要的作用,但目前此領域的綜述文獻較為匱乏。本研究就lncRNA 在原發性腎小球腎炎發生發展過程中的作用進行綜述,總結如下。

1 lncRNA

1.1 lncRNA 概述

lncRNA 為一類長度超過200 個核苷酸且無蛋白質翻譯能力的線性RNA,存在于真核生物中[6],主要由RNA 聚合酶Ⅱ轉錄,并可通過5′帽子、3′多腺苷酸化和剪接進行修飾[7]。因不具備蛋白質編碼功能,lncRNA 曾被視為轉錄“噪聲”,無法發揮生物學功能。迄今為止,僅有極少數的lncRNA 功能被驗證。隨著轉錄組學的進步以及人們對lncRNA 的不斷深入探究,lncRNA 已被證明參與許多人類疾病,如腫瘤[8-9]、神經退行性疾病[10]、腎臟相關疾病[11-12]等。因此,lncRNA 構成了一類重要的新型生物標記物,與細胞生理學、器官穩定和病理過程密切相關。

1.2 lncRNA 分類

目前尚無針對lncRNA 的統一分類標準,根據長度、位置、功能以及靶向機制,可將其進行分類。按照在基因組中lncRNA 與蛋白質編碼基因的相對位置關系,分為正義、反義、雙向、內含子、基因間和增強子lncRNA,其功能取決于所在的位置。同時,lncRNA 通常根據其功能機制分為誘餌、支架、信號和導向lncRNA。近年來,多項研究報道認為,lncRNA 能夠編碼功能性小肽(也稱為微肽),并以特異性的方式對一般生物過程進行調節[13-14],這更深層次地揭示了lncRNA 的臨床價值和復雜性。

1.3 lncRNA 的功能及作用機制

lncRNA 調節基因表達的機制尤其復雜,尚未完全闡明,通常認為具體包括如下幾種: ①通過靶向miRNAs、mRNAs 或者蛋白質,并對其活性與穩定性進行調節,繼而在轉錄后發揮作用;②通過直接結合DNA 或者轉錄因子,從而在轉錄水平上實現調控基因表達的作用;③通過組蛋白修飾、染色質結構重塑或DNA 甲基化以表觀遺傳學方式對靶基因發揮抑制作用[15]。

闡明lncRNA 作用的分子機制是一項具有挑戰性的任務,可以通過應用多種檢測方法來完成。應用定量PCR (quantitative PCR,qPCR)、RNA 熒光原位雜交 (RNA-fluorescent in situ hybridization,RNA-FISH)、RNA-FISH 與隨機光學重建顯微鏡法(stochastic optical reconstruction microscopy,STORM) 相結合以及使用與熒光標簽相連的適配體標記lncRNA 等方法能夠確定lncRNA 在細胞內的定位。利用小干擾 RNAs (small interfering RNAs,siRNAs)、短發夾 RNAs (short hairpin RNAs,shRNAs)、反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASO) 或使用CRISPR/Cas9 技術進行基因敲除/基因敲入,在RNA 沉默介導下敲除lncRNA,從而實現更深入的功能表征。發現lncRNA功能的另一個重要里程碑是二級和三級lncRNA 結構的建立?；瘜W或酶探針、鳥槍二級結構片段分析或計算預測是揭示二級結構最常用的方法。而三級結構和三級lncRNA 相互作用的確定一般采用溶液態核磁共振 (nuclear magnetic resonance,NMR)光譜、小角度散射(small-angle scattering,SAS)、X 射線衍射或冷凍電子顯微鏡來實現。最后,計算建?？捎糜谏钊肓私舛壓腿塕NA 結構預測。由于lncRNA 并非單獨起作用,而是與蛋白質或多分子復合物聯合起作用,因此確定lncRNA 與蛋白質相互作用 (lncRNA-protein interactions,LPIs)對理解其分子功能至關重要。根據針對的是lncRNA 蛋白復合物中的蛋白質還是RNA 成分,可以區分以蛋白質為中心和以RNA 為中心的LPI 測定法。

2 lncRNA 在原發性腎小球腎炎的研究進展

lncRNA 在原發性腎小球腎炎的研究并不深入,相關疾病報道比較少見,大多數lncRNA 的功能及作用機制并不完全明確。越來越多的證據表明,lncRNA 在多種細胞功能中發揮作用。近年來,隨著人類全基因組測序技術的日益發展,關于lncRNA 與原發性腎小球腎炎之間的關系也逐漸得到論證。

2.1 lncRNA 與IgA 腎病

IgA 腎病屬于一種由IgA 形成的復合物沉積于腎小球系膜區的疾病,可導致腎小球炎癥和進一步的腎損傷[16]。在IgA 腎病中,lncRNA 不僅參與細胞因子和炎癥的調節,還與B 細胞和巨噬細胞有關。Bi 等[17]研究表明,lncRNA 垂體瘤轉化因子3假基因(pituitary tumour-transforming 3 pseudogene,PTTG3P) 誘導糖基化IgA 的異常產生,此外,與健康受試者相比,lncRNA PTTG3P 在IgA 腎病患者腎組織樣本中過表達,且IgA 腎病患者尿PTTG3P水平也高于健康對照組,同時,PTTG3P 過表達可刺激B 細胞生長并增強細胞周期蛋白D1 和Ki-67的表達,并誘導白介素-1β (interleukin-1β,IL-1β) 和IL-8 的產生。既往研究[18]也認為,IL-1β和IL-8 在IgA 腎病的發生和發展中起著關鍵作用。因此,PTTG3P 在IgA 腎病的進展中發揮著關鍵作用。Shen 等[19]研究提出,通過檢測lncRNA 結直腸癌差異表達基因(colorectal neoplasia differentially expressed,CRNDE)、含pyrin 結構域NOD 樣受體家族3 (NOD-like receptor family pyrin domain containing 3,NLRP3) 炎癥小體相關蛋白在外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs) 和J774 A.1 細胞中的表達水平,并檢測IgA腎病患者血清和體外IgA 腎病模型細胞上清液中的炎癥細胞因子水平,結果顯示,與對照組相比,CRNDE 和NLRP3 炎癥小體相關蛋白在PBMCs 和J774 A.1 細胞中的表達以及在IgA 腎病患者血清和IgA-IC 誘導的J774 A.1 細胞中的表達均顯著上調,CRNDE 沉默下調了NLRP3 炎癥小體相關蛋白和細胞上清液中IL-1β、腫瘤壞死因子-α (tumour necrosis factor-α,TNF-α) 和白介素-12 (interleukin-12,IL-12) 的水平,而NLRP3 過表達則逆轉了這些作用,此外,CRNDE能夠與NLRP3 相互作用并促進NLRP3 表達,抑制CRNDE則可降低NLRP3蛋白水平,并促進TRIM 家族成員31 (TRIM family member 31,TRIM31) 介導的NLRP3 泛素化和降解,故lncRNACRNDE可通過促進巨噬細胞中NLRP3 炎癥小體的激活而加劇IgA 腎病的進展。一些lncRNA 可以用作疾病的生物標志物。IgA 腎病患者中lncRNA MYEF2-1.1 表達較健康對照組低85倍,而ALOX15 P1-ncNR045985 表達較健康對照組高5.15 倍[20]。Sun 等[21]報道則指出,IgA 腎病兒童中,lncRNA 中含有5 個PH 結構域的反義RNA1(PH domain containing 5 antisense RNA1,FGD5-AS1) 和PTEN 下調表達,miR-196b-5p 上調表達,同時,體外實驗證實,FGD5-AS1 可通過miR-196b-5p 靶向磷酸酶與張力蛋白同源物(phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,PTEN) 介導的JNK/c-Jun 信號轉導來抑制IgA 腎病,FGD5-AS1 可能是IgA 腎病的一個新的治療靶點。He 等[22]通過對204 例IgA 腎病患者進行分析發現,與健康對照組相比,IgA 腎病患者lncRNAH19 表達顯著下調,通過調整其他潛在的臨床、病理和治療因素后,發現H19 是IgA 腎病預后的保護因素 (HR=0.52,95 %CI: 0.32～0.84,P=0.008),與H19≤0.097 患者相比,H19 ＞0.097 的IgA 腎病患者5 年內腎臟進展風險降低約70 %(HR=0.30,95 %CI: 0.12～0.74,P=0.009),故高水平的lncRNAH19 通常提示IgA 腎病患者5年內腎功能改善。Guo 等[23]研究顯示,lncRNAG21551 在IgA 腎病患者中顯著下調,有趣的是,與lncRNA-G21551 最接近的蛋白質編碼基因被發現能夠編碼免疫球蛋白G 的Fc 片段低親和力受體。Wen 等[24]則觀察到IgA 腎病腎組織中細胞間黏附分子-1 (intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1) 相 關 lncRNA (related long noncoding RNA,ICR) 水平顯著升高,且ICR 參與了腎臟纖維化過程,其作用機制為抑制蛋白激酶B (protein kinase B,PKB/Akt)/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR) 信號通路并減少Akt 和mTOR 磷酸化,從而減弱轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1) 誘導的腎近端小管細胞纖維化改變。故lncRNA 有望作為一種潛在的新型非侵入性IgA 腎病生物標記物。最近,在IgA 腎病患者和健康個體的單核細胞中進行的微陣列分析發現了250 多種差異表達的lncRNA和mRNA,主要參與先天免疫反應的調節[25]。在應用系統生物學方法的其他研究中也發現了類似的結果,PBMC 中差異表達的約217 個lncRNA 已被認為是參與IgA 腎病病理生理學的潛在因素,其中HOX 轉錄反義 RNA (HOX transcript antisense RNA,HOTAIR) 是IgA 腎病中調節差異表達基因/miRNA 最重要的lncRNA[26]。通過進一步探索lncRNA 在IgA 腎病中的功能和調節機制,有助于確定潛在的篩選生物標志物和新的治療靶點。

2.2 lncRNA 與膜性腎病

膜性腎病是一種腎臟特異性自身免疫性疾病,是成人腎病綜合征最主要的病因。Huang 等[27]通過使用實驗性膜性腎病小鼠模型鑒定了第一個失調的lncRNA,X 染色體失活特異性轉錄物(X chromosome inactivation,XIST) 和核斑點旁組裝轉錄1 (nuclear paraspeckle assembly transcript 1,NEAT1),腎小球細胞以及腎小管上皮細胞中XIST、NEAT1 水平明顯升高,而XIST 啟動子區組蛋白H3 第27 位氨基酸三甲基化 (Tri-methylation of lysine 27 on histone H3,H3K27me3) 水平在小鼠膜性腎病腎臟中顯著下調,同時還發現,包括膜性腎病在內的腎小球腎炎患者尿液XIST 顯著升高。lncRNA 可通過調節細胞凋亡影響膜性腎病進程。Jin 等[28]研究顯示,膜性腎病患者的腎組織中lncRNA XIST 和血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ) 明顯上調表達,AngⅡ可誘導足細胞XIST 增加和細胞凋亡,XIST 下調可逆轉AngⅡ誘導的足細胞凋亡,并通過負調控miR-217 來上調Toll 樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4) 表達,TLR4 表達上調可促進足細胞凋亡和膜性腎病進程,反之,XIST 下調可通過miR-217/TLR4 途徑改善足細胞凋亡,這可能會有利于改善膜性腎病。NEAT1 在白蛋白刺激的腎小管上皮細胞和膜性腎病腎小管組織中呈時間依賴性上調,在白蛋白刺激的近端腎小管上皮細胞中,NEAT1過表達可增加細胞凋亡并減少細胞增殖,并通過抑制Noxa (一種Bcl-2 同源物3-唯一的蛋白質) 介導的抗凋亡蛋白活性,進而誘導細胞凋亡并促進膜性腎病的進展[29]。lncRNA 參與了lncRNA-miRNA-mRNA 共表達網絡以及ceRNA 網絡的構建。通過構建一個由4 個mRNA(EPB41L5、FAM43A、PRKG1、TTC14)、3 個lncRNA(LINC00052、LINC00641、N4BP2L2-IT2)和5 個miRNA (hsa-miR-145-5p、hsa-miR-3605-5p、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-497-5p、hsa-miR-148b-3p)組成的ceRNA 網絡發現,LINC00052-hsa-miR-145-5p-EPB41L5、LINC00052-hsa-miR-148a-3p-FAM43A、LINC00641-hsa-497-5p-PRKG1 下調可能與膜性腎病的發展有關[30]。另外,通過lncRNA-miRNA-mRNA 網絡構建,探索ceRNA 的相互作用,在KCNQ1OT1-miR-204-5p-SRY盒轉錄因子4 (SRY-box transcription factor 4,SOX4)途徑中,mRNA SOX4 可通過與海綿狀KCNQ1 OT1-miR-204-5p 相互作用促進膜性腎病的進展[31]。lncRNA 引起的表觀遺傳失調所致的基因表達變化越來越被認為是促進膜性腎病發生發展的重要因素。

2.3 lncRNA 與系膜毛細血管性腎炎

系膜毛細血管性腎炎的病理特征為系膜擴張以及在系膜中能夠發現免疫球蛋白沉積,但其病因機制仍不清楚。Yu 等[32]報道表明,lncRNA uc.412過表達可明顯促進系膜細胞增殖,且通過RNA 測序評估過表達uc.412 的系膜細胞轉錄譜,共鑒定出462 個上調基因以及843 個下調基因,且這些差異表達基因參與了多條與系膜細胞增殖相關的信號通路,這可能有助于為探究治療系膜增生性腎臟疾病的新方法提供指導。通過微陣列表達分析測試表明數千個lncRNA 和蛋白質編碼基因在IgA 陰性系膜毛細血管性腎炎中顯著差異表達,一些lncRNA與其相鄰的蛋白質編碼基因密切相關并協同表達,lncRNA 網絡調控失衡可能是IgA 陰性系膜毛細血管性腎炎發展的一種潛在機制[33]。

2.4 lncRNA 與局灶節段性腎小球硬化癥

局灶節段性腎小球硬化癥由腎小球中足細胞功能障礙和凋亡引起。lncRNA 對該病的作用知之甚少。與其相關的lncRNA 之一是lncRNA LOC105375913,lncRNA LOC105375913 表達增加可降低miR-27b 水平,促進snail 過表達,并導致腎小管間質纖維化[34]。局灶節段性腎小球硬化癥患者的足細胞中lncRNA LOC105374325 上調表達,其機制與P38/CCAAT增強子結合蛋白β (CCAAT enhancer-binding protein β,C/EBPβ) 通路的激活有關,進而可增加Bcl-2 相關X、促凋亡蛋白 (BCL2-associated X,apoptosis regulator,Bax) 和BCL-2 拮抗/殺傷因子1 (BCL2 antagonist/killer 1,Bak) 表達,并降低患者足細胞中miR-34c 和miR-196a/b 水平,從而導致足細胞凋亡[35]。

3 小結及展望

越來越多的lncRNA 已經顯示出編碼蛋白質的能力,這可能與其在疾病中的作用機制有關。由于lncRNA 在不同物種、生命階段、組織和器官中的差異和特異性表達,推測lncRNA 作為生物標記物具有更好的潛力,并可能在不同細胞、組織和生命周期中發揮作用。隨著基因組學的發展,已經發現了大量與人類疾病有關的lncRNA,包括腎臟疾病。lncRNA 作為原發性腎小球腎炎發病機制、診斷生物學標記物以及治療靶點探究的新領域,能夠為原發性腎小球腎炎的診斷和治療提供科學根據。盡管目前已初步了解了lncRNA 在原發性腎小球腎炎中的調控機制,但其介導的基因表達調控網絡及作用機制尚需開展深入研究。隨著人類全基因組測序技術的飛速進步,有望發現更多與原發性腎小球腎炎有關的lncRNA,并開展更多有意義且更深層次的研究。