基于細胞自噬調控的中藥治療潰瘍性結腸炎藥理機制研究進展

梁宇晗 王洪雙 何慧彬 鄭敏 趙琰 李彤 趙沛東 王石紅

潰瘍性結腸炎(ulcerative coltis,UC)是一種原因不明的慢性非特異性結腸炎癥性疾病,臨床上主要表現為持續或反復發作的腹瀉、腹痛、里急后重和粘液膿血便,多累及全結腸甚至回腸,以直腸和乙狀結腸最為常見[1]。其發病與上皮屏障功能障礙、免疫失衡、遺傳易感性及外界環境等密切相關[2]。目前的研究認為自噬參與UC的發生發展,通過自噬改善UC疾病活動是一種可行的治療方法[3]。

自噬是真核細胞在應激狀況下所產生的一種非損傷性應答,通過溶酶體降解微生物、受損蛋白及損傷衰老的細胞器,實現重新利用和更新,從而維持細胞內環境的穩態平衡,是真核細胞獨有的自我保護機制[4]?；谧允傻闹嗅t藥療法已被廣泛應用于臨床治療,大量研究表明中藥單體及復方中的有效成分能夠通過調控自噬改善UC癥狀,具有潛在的臨床應用價值?，F就近年來中藥單體(或其活性成分)及復方通過調控自噬改善UC的藥理機制研究進行綜述,旨在為深入研究中藥治療UC提供新的思路。

1 改善腸道黏膜屏障功能

腸粘膜屏障受損是導致UC發生發展的一個重要因素。腸道黏膜遭到破壞,通透性增加,腸道內各種毒素產物侵入腸道上皮,引起細菌移位、固有免疫損傷、線粒體功能障礙和鐵死亡等病理過程[5]。研究顯示,自噬在維持腸黏膜穩態方面發揮著重要作用[6]。

1.1 修復受損黏膜機械屏障

腸粘膜機械屏障是黏膜屏障的重要組成部分,主要由黏膜上皮細胞及其緊密連接(tight junction,TJ)成分組成,其中咬合蛋白(Occludin)是TJ蛋白主體組成成分,可與緊密連接蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)結合以封閉細胞間隙,形成防滲透屏障,抵御病原微生物入侵[7]。研究顯示,低、中、高劑量人參敗毒散可上調腺苷酸活化蛋白α(activated protein kinase α,AMPKα)mRNA表達水平,增加磷酸化蛋白腺苷酸活化蛋白激酶(phosphorylated adenosine monophosphate activated protein kinase,p-AMPK)、磷酸化Unc-51樣激酶1(Unc-51 like kinase 1,ULK1)、Occludin蛋白表達及增高LC3Ⅱ/Ⅰ值,降低p62、封閉蛋白-2(Claudin-2)表達,其中以中劑量組干預效應最明顯,表明人參敗毒散可能通過激活AMPK/ULK1自噬通路,調節緊密連接蛋白Occludin、Claudin-2的水平,改善結腸黏膜通透性,并修復腸道黏膜機械屏障損傷[8]。

另有研究顯示上游調控因子AMPK可降低自噬調控核心因子哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的活性以促進自噬發生,AMPK/mTOR通路介導的自噬能夠明顯緩解UC癥狀[9]。應藝[10]先后進行了動物實驗和細胞實驗,觀察黃芪多糖對結組織中黏膜屏障相關指標的影響,包括Claudin-1、Occludin蛋白,自噬效應蛋白(Beclin1)、微管相關蛋白輕鏈3(LC3B)、泛素結合蛋白(p62)和炎癥相關指標腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白細胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-18、IL-8等,以及自噬相關基因Atg5腸、Atg7、Atg16L,研究結果認為黃芪多糖可以提高組織自噬能力,有效緩解腸道炎癥及腸粘膜損傷。

1.2 減輕腸上皮細胞凋亡

細胞凋亡是細胞自身正常死亡過程,在機體防御體系中發揮重要作用,UC發病過程中存在結腸上皮細胞凋亡情況,而細胞自噬與細胞凋亡關系密切[5,11]。研究表明自噬的激活能直接控制UC中炎癥因子TNF誘導的腸上皮細胞凋亡。

木樨草素是一種天然黃酮類化合物,高劑量的木樨草素可明顯改善DSS介導發生的結腸上皮損傷、水腫和結構扭曲,通過抑制磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylin-ositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)、核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信號通路,增加細胞外信號調節激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)1/2磷酸化,減弱caspase-9、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和cleaved PARP等凋亡相關蛋白表達,抑制自噬水平,干預結腸組織細胞凋亡[12]。在李蘭珍等[13]觀察芍藥苷治療UC大鼠的實驗中,發現芍藥苷能夠下調抗凋亡基因B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)表達和TNF-α、IL-6含量,上調自噬相關蛋白Beclin1表達,推測芍藥苷可能通過抑制NF-κB信號通路,解除自噬抑制,促進了腸上皮細胞的功能修復。

經吳玉泓團隊驗證,理中湯合四神丸可激活脾腎陽虛型UC大鼠JNK/Beclin1/Bcl-2自噬信號通路,經中藥干預后結腸組織中的絲氨酸蘇氨酸激酶(c-Jun N-terminal kinase 1,JNK1)、Bcl-2、Beclin1、LC3B、損傷調節自噬蛋白1(damage regulated autophagy modulator 1,DRAM1)相關蛋白和Atg5、Atg12自噬相關基因表達被抑制,同時P62表達上調,自噬水平被抑制,過度自噬被避免,緩解了結腸粘膜細胞凋亡,保護了結腸黏膜[14-15]。健脾清熱活血方是勞紹賢教授總結多年臨床治療UC的經驗擬成的方子,張濤等[16]運用健脾清熱活血方治療潰結癌變小鼠,結果中藥組P85蛋白、周期蛋白依賴性蛋白激酶1(cyclin-dependent protein kinase 1,CDK1)、P85 mRNA、p-Akt mRNA表達下降,推測健脾清熱活血方可能通過調節PI3K/Akt/mTOR信號通路,抑制細胞凋亡與自噬,促進腸道炎癥緩解與黏膜修復。

2 調節免疫炎癥反應

在UC模型中,免疫細胞的浸潤會影響腸道粘膜穩態和功能,進一步導致炎癥反應。自噬參與機體免疫系統的調節,自噬缺陷會導致細胞毒性T細胞向T輔助淋巴細胞募集,增加炎癥因子表達,誘發炎癥反應[17]。因此,通過調節腸道炎癥因子水平來抑制免疫細胞的浸潤也可能是治療UC的一種方法。

2.1 抑制NLRP3炎性小體活性

NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NOD-like receptor domain-containing protein 3,NLRP3)、銜接蛋白ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,凋亡相關斑點樣蛋白)和半胱氨酸蛋白酶前體(pro-Caspase-1)組成炎癥小體,活化的NLPR3炎癥小體可以對pro-Caspase-1蛋白進行剪切形成Caspase-1,Caspase-1處理pro-IL-1β和pro-IL-18,形成成熟的IL-1β和IL-18[18],然后觸發免疫反應[19]。丁文文[20]實驗中的治療組在給予吳茱萸堿后,結腸組織炎性細胞浸潤減少,髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、IL-1、IL-18水平降低,并破壞ASC自身寡聚化及ASC與Caspase-1的共定位而阻礙NLRP3炎性小體的組裝抑制其激活,LC3-Ⅱ及p62蛋白的變化初步證明吳茱萸堿可通過增強自噬抑制NLRP3炎性小體的激活。劉琦[21]的研究證明NLRP3炎性小體參與UC發生發展過程。忍冬苷是金銀花中最豐富的成分之一,胡乃華團隊[22]認為忍冬苷可能通過激活EZH2-ATG5-NLRP3通路,增強自噬,加速NLRP3炎癥小體的降解,并顯著緩解UC。

2.2 減輕炎癥損傷

劉曉蘭等[23]運用蒼術揮發油干預UC大鼠,治療組IL-6、TNF-α明顯被抑制,Beclin1蛋白、p62 mRNA、LC3Ⅱ/Ⅰ比值明顯上升,說明蒼術揮發油保護大鼠結腸組織免受炎癥損傷,可能與促進自噬有關。雷公藤多苷片具有很強的抗炎和免疫調節作用,王章流等[24]用其灌胃治療UC小鼠,認為雷公藤多苷片通過下調LC3Ⅱ/Ⅰ比值抑制自噬活性,從而緩解DSS誘導的小鼠結腸急性炎癥反應。

濕生扁蕾酮提取自龍膽草,具有抗腸纖維化、抑菌、消炎等藥理作用。張旭東等[25]運用各劑量濕生扁蕾酮治療腸纖維化UC大鼠模型,發現干預后結腸組織炎癥明顯減輕,Atg16L1、LC3蛋白表達下降,推測濕生扁蕾酮通過抑制自噬活性,發揮減少炎性因子和抵抗結腸纖維化的作用。復方蜥蜴散是朱西杰教授根據多年臨床經驗總結用來治療UC的自擬方,能夠調節腸道菌群紊亂,維持腸道穩態[26]。王藝臻等[27]還發現此方能夠使自噬恢復正常,實驗結果高劑量組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下調、p62水平上升,闡述了復方蜥蜴散通過維持正常自噬,清除受損細胞器、蛋白質,隔離有害蛋白,明顯緩解UC大鼠粘液膿血便癥狀,修復腸道潰瘍,降低炎癥反應。

羅云堅教授團隊認為病變黏膜組織內過多沉積的異常蛋白、炎性因子、受損細胞器等可通過干預Akt/mTOR信號通路,導致通路下游炎性因子失衡,而通過實驗驗證發現以清解伏毒法立方的調腸消炎片,可調控巨噬細胞的自噬狀態,影響促炎因子IL-1β、抑炎因子IL-4的表達,有效緩解了UC大鼠結腸組織炎癥反應,促進潰瘍愈合[28]。牟永旭等[29]研究半夏瀉心湯對UC的作用機制,經半夏瀉心湯干預后,各劑量組血清中TNF-α、IL-6含量減低,結腸組織中PI3K和Akt蛋白也有不同程度的降低,結果證明半夏瀉心湯緩解UC炎癥反應可能與抑制促炎因子的表達和PI3K/Akt信號通路的活化促進自噬有關。

青藤堿提取自中藥青風藤,具有良好的抗炎和免疫抑制活性作用。謝小榮等[30]運用鹽酸青藤堿治療UC小鼠,結果表明經治療后TNF-α、IL-6含量降低,IL-10含量升高,改善炎癥因子之間分泌失衡狀態,同時p62蛋白表達顯著降低,Beclin1、LC3B蛋白表達顯著升高,提示鹽酸青藤堿緩解結腸炎癥損傷可能與解除自噬抑制有關。

2.3 調節腸道黏膜免疫應答

翻白草是彝醫用來治療腸炎、腹瀉的常用藥物。劉宇等[31]運用翻白草治療UC大鼠,發現其可能是通過調節NF-κB的表達來防止過度的炎性小體激活,翻白草組結腸組織中p62、線粒體自噬標志蛋白parkin、NF-κB的mRNA轉錄水平上升,標志著線粒體自噬的激活,同時T細胞的生成增加,調控免疫反應,抑制了體內促炎因子的表達,增加了抗炎因子的含量,最終恢復腸道黏膜免疫功能,調整腸黏膜免疫失衡帶來的大鼠腸黏膜損傷。王堅衡[32]實驗驗證白藜蘆醇可以激動小鼠結腸組織中沉默調節蛋白1(recombinant sirtuin 1,SIRT1)、mTOR蛋白,下調Atg12、Beclin1、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ蛋白表達,激活SIRT1/mTOR信號通路,降低自噬水平,緩解結腸黏膜病理變化,減少TNF-α、IL-1β、IL-6炎癥因子的聚集,增加IL-10表達,調節CD4+T、CD8+T細胞的比例,避免Th1/Th2的免疫調節失衡,從而治療UC。

司曉麗等[33]實驗驗證了芍藥苷可通過上調自噬水平減輕葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate,DSS)造成的大鼠腸道損傷,經干預后組織中炎癥因子IL-17、TNF-α及細胞間黏附分子(intercellular adhesion molecules,ICAM)分泌減少,自噬相關因子LC3BⅡ、Beclin1水平上調。IL-17是IL家族研究最廣泛的促炎細胞因子,被認為是是連接固有免疫和獲得性免疫的橋梁,其與受體結合,可激活MAPKs、NF-κB等信號通路,誘導IL-6、IL-8、ICAM-1等促炎細胞因子和趨化因子釋放,進而導致單核細胞、中性粒細胞募集及炎癥的產生[34]。

3 調節腸道菌群

腸道菌群失衡是UC發病機制之一,在UC發病過程中起著重要作用。腸道菌群失衡是由于腸道菌群數量失調引起的,它可以通過多種機制引起UC的發生發展,益生菌群通?？梢哉{節腸道菌群平衡,起到緩解結腸炎作用[35]。有些中藥成分可能通過調節腸道菌群促進自噬進而改善UC癥狀。

SU等[36]研究黃柏堿對UC的治療作用,進行網絡藥理學驗證表明黃柏堿是復方黃柏液的主要成分,且靶點主要影響AMPK和mTOR信號通路,進一步構建UC動物模型,經干預后黃柏堿組p-AMPK/AMPK比值、自噬標記的LCII/LCI比值增加,p-mTOR/mTOR比值下降,表明黃柏堿干預可以促進自噬水平增加。腸道菌群測序分析還發現黃柏堿組小鼠的菌群更接近正常,增加了菌群豐度和有益菌含量,提示黃柏堿能夠減少腸道損傷調節腸道菌群可能與調節AMPK-mTOR信號通路增強自噬有關。

鹽酸小檗堿(黃連素)是許多常用中藥(黃連、黃柏)的主要成分。CAO等[37]運用鹽酸小檗堿治療炎癥性腸病動物模型,實驗結果顯示鹽酸小檗堿高劑量組丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量降低,總抗氧能力、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶(superoxide dismutas,SOD)含量增加,結腸緊密連接蛋白ZO-1、ZO-2、E-鈣粘蛋白、ZEB1、Occludin mRNA表達水平上調,slug蛋白表達增加,N-鈣粘蛋白表達下降。同時,鹽酸小檗堿高劑量組Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)、NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB,IκB)、NF-κB mRNA表達顯著降低,IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA表達也降低,表明TLR4/NF-κB通路受到抑制,Atg5、Atg7、LC3蛋白的表達增加,p62表達下降和p-mTOR表達增加,表明mTOR復合物和自噬激活,厚壁菌門/擬桿菌門比率和乳酸桿菌豐度也增加,總體微生物群達到健康水平,說明鹽酸小檗堿能夠緩解結腸損傷和炎癥、維持腸道抗氧化系統和微生物穩態,可能與抑制TLR4/NF-κB炎癥通路并激活mTOR復合物和自噬有關。

4 減輕氧化應激損傷

4.1 增強抗氧能力

在UC炎癥區域,由于血管受損和代謝增加導致耗氧量增加,黏膜微環境處于缺氧狀態,造成黏膜保護因子受損,腸粘膜屏障遭到破壞;氧化應激是氧化與抗氧化作用失衡的反應,其中活性氧(reactive oxygen species,ROS)積累過多,而可清除氧自由基的SOD、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)等酶活性減低,造成周圍組織損傷,結腸組織屏障受損[38-39]。

金絲桃苷屬黃酮醇苷化合物,主要存在于金絲桃屬和山楂屬植物中。于曉萍等[40]的實驗中,金絲桃苷對大鼠結腸炎癥有明顯的治療作用,通過下調結腸組織中IL-1β、TNF-α、MDA、MPO水平,提升SOD活性,LC3、Beclin1水平上升,p62水平下降,證明金絲桃苷可增強自噬水平,發揮抗炎抗氧化作用。氧化苦參堿是從豆科植物苦參中提取出的主要活性成分,具有較強的抗炎、抗癌、抗氧化、抗纖維化等作用[41]。經氧化苦參堿干預的UC小鼠結腸黏膜細胞的ROS、MDA和MPO含量顯著減少,SOD、GSH-Px含量均增加,Atg5和Beclin1蛋白表達顯著增加,證明氧化苦參堿減輕由ROS引起的一系列級聯反應可能與提高自噬水平有關[38]。

薯蕷皂苷是一種植物甾體皂苷,具有抗炎、抑菌、降血脂等作用。李瀚等[9]研究薯蕷皂苷的機制發現其能夠減輕DSS對SOD、GSH的抑制,增加p-AMPK蛋白水平,降低p-mTOR表達。同時,經其干預后Beclin1、Atg5蛋白水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著增高,p62蛋白顯著下降,自噬被激活,因此研究分析薯蕷皂苷可能通過調節AMPK/mTOR信號通路促進自噬,抑制氧化應激。

白術內酯具有抗炎、抗腫瘤等作用。任燕等[42]通過實驗白術內酯Ⅲ干預UC小鼠模型,探究其治療機制,結果SOD、GSH-Px含量明顯升高,MDA含量明顯降低,且Beclin1蛋白、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯升高,p62表達明顯降低,鏡下觀察也發現白術內酯Ⅲ組線粒體膨脹變形、受損線粒體被自噬小體所吞噬,并且溶酶體與受損線粒體進行了融合,表明白術內酯Ⅲ可能通過調節自噬,清除過氧化物,緩解UC炎癥。

中藥方劑香連丸出自《太平惠民和劑局方》,臨床主要用于治療濕熱痢疾。經香連丸低、中、高劑量干預的UC小鼠結腸組織中MDA表達下降,SOD、GSH-Px活性增加,抗氧化能力得到增強。自噬方面,Beclin1、LC3Ⅱ表達及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上調,LC3Ⅰ蛋白表達下降,表明香連丸可能通過促進自噬和降低氧化應激反應,改善結腸損傷,促進組織修復[43]。

4.2 激活線粒體自噬

線粒體自噬可被氧化應激激活,且線粒體自噬可減少氧化應激。在苗金雪等[44]的實驗研究中,黃芩湯可通過激活人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因誘導的假定激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)/E3泛素連接酶(Parkin)自噬通路,啟動線粒體自噬,清除組織內受損的線粒體,緩解UC大鼠的氧化應激反應。地馬煎劑由芍藥湯化裁而成,是查安生教授治療UC的經驗方,能夠有效控制輕、中度UC活動。在王睿等[45]的研究中,地馬煎劑組大鼠結腸組織中腺病毒E1B相互作用蛋白3(BCL2/adenovirus E1Binte racting protein3,BNIP3)、Beclin1、LC3蛋白相對表達均增高,研究提示地馬煎劑可通過缺氧誘導因子1α/BNIP3/Beclin1通路,激活線粒體自噬對抗UC炎癥反應。BNIP3是線粒體自噬的正向調控通路中的關鍵蛋白,后期實驗中地馬煎劑各劑量組黏膜組織BINP3蛋白及BNIP3 mRNA表達均升高,提示線粒體自噬水平得到增強,促進了腸道炎癥修復[46]。

5 結語

中醫藥治療UC有著確切的臨床療效。通過以上對近年來國內外基于細胞自噬調控的中藥治療UC藥理機制研究進展的總結,可以發現中藥單體(或其活性成分)和復方制劑能夠通過調控自噬相關蛋白表達進而調控自噬通路從而發揮治療UC的作用,其主要作用靶點集中在Beclin1、p62、LC3、炎性細胞因子和其他作用相關蛋白,主要作用信號通路有AMPK/mTOR、PI3K/Akt/mTOR、Akt/mTOR、SIRT1/mTOR、NF-κB及PINK1/Parkin等信號通路。隨著對細胞自噬調節機制研究的深入和認識,應注意到自噬具有雙重調節作用,自噬太過與不足皆會影響UC進展,在疾病治療上需要深入研究是應該誘導自噬還是抑制自噬。同時,目前尚缺少基于細胞自噬調控治療UC的臨床研究。因此,進一步分析中藥對細胞自噬影響機制以及研究中藥在UC中發揮藥理作用的具體機制十分必要。