通過抑制氧化應激損傷治療炎癥性腸病的前景展望

唐 樣,王宜君,王璐瑤,宋 雪

(1.蚌埠醫科大學第一附屬醫院 中心實驗室,安徽 蚌埠 233004;2.蚌埠醫科大學 臨床醫學院,安徽 蚌埠 233030)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是一種慢性胃腸道疾病,其主要類型可分為潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)和克羅恩病(Crohn′s disease,CD)兩種。IBD的病理特征主要是腸道出現潰瘍和腸道黏膜存在大量炎性細胞浸潤等[1]。目前,IBD的發病機制尚不明確,但越來越多的證據表明,氧化應激(oxidative stress,OS)與IBD中表現出的某些典型臨床特征有關,并且在IBD的發病機制和發展過程中起重要作用。氧化應激可引起機體組織細胞氧化還原狀態的失衡,并大量積累活性氧(reactive oxygen species,ROS),誘發氧化應激損傷擾亂細胞內環境穩態,從而間接參與或直接導致腸道菌群紊亂、免疫反應失調、黏膜屏障功能改變、自噬功能異常以及腸道纖維化,加重腸道炎癥以及胃腸道黏膜上皮損傷[2-3]。因此,探索氧化應激在IBD中的作用機制,有望揭示IBD潛在的發病機制,為臨床診療方案提供可行的新思路。

1 腸黏膜上皮細胞與氧化應激

在IBD中,氧化應激可損傷腸黏膜上皮細胞(intestinal epithelial cells,IECs),破壞黏膜屏障和免疫系統,導致腸道黏膜損傷和炎癥擴散,引起慢性持續性的炎癥,出現如杯狀細胞丟失、隱窩細胞增生、黏液生成減少和潰瘍等癥狀,從而造成腸道穩態失衡,IBD加重[4]。

1.1 IECs

IECs是由杯狀細胞、吸收細胞和內分泌細胞組成的單層柱狀上皮細胞,但不同部位的IECs組成成分有所不同,如在小腸中,IECs的組成成分還包含有未分化細胞和Paneth細胞。腸道內外環境間存在著多種溝通媒介,而IECs作為多種媒介中的一種,其參與組成了機體的腸黏膜屏障,并發揮著分泌、消化和吸收等功能,被認為在IBD的發病機制中起著核心作用[5-6]。

1.2 腸黏膜屏障受損

IECs在人體腸道內形成的細胞屏障,對維持黏膜穩態至關重要。然而,氧化應激對IECs所造成的異常損傷,會導致其黏膜屏障功能被破壞。ROS引發的氧化應激會通過誘導蛋白質構象改變,使蛋白質功能部分或完全喪失。此外,ROS還可引起脂質過氧化來加速細胞損傷,從而引發IECs嚴重的炎癥反應[7]。在黏膜的炎癥反應過程中,IECs又可通過激活由炎癥細胞因子介導的NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)和誘導型一氧化氮合酶(inducible NOS,iNOS)等來產生更多的ROS。隨著ROS在機體內大量積累,細胞骨架蛋白逐漸遭受到嚴重的氧化應激損傷,這也導致了IECs間的緊密連接結構陸續被破壞,最終使得腸黏膜屏障受損。

當腸黏膜屏障受損嚴重時,腸黏膜中的某些由輔助性T細胞(T helper cells,Th)介導生成的細胞因子[例如白細胞介素-1(interleukin-1,IL-1)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等]會產生異常正反饋,刺激IECs繼續產生大量的ROS,促進氧化應激損傷,導致嚴重的惡性循環,腸黏膜屏障損傷加重[8]。

1.3 抗菌肽分泌減少

抗菌肽主要由Paneth細胞分泌,可分為殺菌肽和防御素兩類,在控制細菌和抗炎方面發揮重要作用[4,9]。然而隨著IECs周圍的微血管募集炎癥介質,炎癥進一步擴散,使得Paneth細胞被氧化應激損傷,導致抗菌肽的分泌相對減少,菌群調控和抗炎作用相對減弱,IBD病人也因此表現出腸道菌群紊亂和炎癥反應加重的臨床癥狀。CD病人存在由氧化應激損傷所導致的抗菌肽有關基因表達缺陷,特別是與UC病人相比,人β-防御素(human β defensins,HBD)中的HBD2、HBD3和HBD4的誘導作用在CD病人的結腸中有所降低。此外,CD病人回腸還出現Paneth細胞衍生防御素(human defensins,HD)中HD5和HD6表達減少[10]。

2 黏膜免疫細胞與氧化應激

在IBD影響下,機體的適應性免疫系統被激活,幼稚輔助性T細胞(Th0)分化為Th1、Th2或Th17。許多研究[11]表明,在CD中觸發的Th1反應,可通過產生干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)誘導腸細胞凋亡,并激活巨噬細胞釋放TNF-α,介導NOS等來產生大量的ROS,從而引發氧化應激損傷黏膜屏障。在UC中,自然殺傷(natural killer,NK)細胞生成的Th2介導細胞因子(如IL-13、IL-25等)可引起免疫應答和腸道通透性增加,間接促進氧化應激損傷IECs,并向NK細胞提供正反饋[12-13]。在Th17反應中釋放的IL-17A可將中性粒細胞和巨噬細胞募集到炎癥部位,通過髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、NOX和NOS等產生大量的ROS,從而介導氧化應激損傷炎癥部位,參與到IBD的發病機制中[14]。

在炎癥反應期間,其他免疫細胞(如淋巴細胞和單核細胞)也可以在呼吸、前列腺素和白三烯代謝過程中增加ROS的產生,導致嚴重的組織損傷。此外,ROS和炎癥細胞因子在淋巴管表面可誘導黏膜地址素細胞黏附分子-1(mucosal address element cell adhesion molecule-1,MAdCAM-1)參與腸道炎癥部位淋巴細胞的選擇性招募,并由此來調控淋巴細胞在腸間質內的運動和積累,使細胞間連接紊亂,加劇ROS和炎癥細胞因子的釋放,引起更嚴重的黏膜氧化應激損傷,導致IBD的進一步發展[15]。在免疫系統各免疫細胞的參與下,炎癥細胞浸潤增加和ROS生成增多,導致氧化應激進一步損傷胃腸道組織,形成惡性循環,從而加重了IBD。

3 腸道菌群與氧化應激

腸道菌群能夠參與調節胃腸道的運動、腸上皮的發育、營養吸收和免疫反應,在維持胃腸道正常功能方面起著重要作用。值得注意的是,腸道菌群紊亂引起ROS的持續產生,介導了機體的氧化還原穩態失衡 ,從而導致氧化應激損傷機體大分子物質(如脂質和蛋白質等),影響腸道細胞的穩態以及胃腸道菌群的生物多樣性,誘發IBD[16-18]。

在氧化應激損傷和腸道菌群紊亂的雙重作用下,腸黏膜屏障持續受損,導致黏膜通透性異常增強,這也使得致病菌易于穿過黏膜上皮屏障,接觸并刺激IECs表達模式識別受體(pattern-recognition receptors,PRRs),呈遞抗原激活免疫細胞[19]。此外,在共生菌的刺激下,IECs可利用NOX等產生ROS。其中H2O2可通過氧化Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)上對氧化還原敏感的半胱氨酸殘基(cysteine residues,Cys)來激活核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)信號通路,從而提高機體抗氧化的能力[20]。但高含量的H2O2也有可能會把Cys中的硫代酸根陰離子氧化成亞磺酸或磺酸物質,這種不可逆的改變將影響Nrf2信號通路發揮其維持氧化還原平衡和抑制氧化應激損傷的功能,導致氧化應激損傷加重[21]。

事實上,ROS引起氧化應激損傷的差異取決于其對靶標的特異性和選擇性以及細胞中ROS的分布差異[22]。細菌驅動的尿嘧啶會引發IECs中雙氧化酶(double oxidase,DUOX)依賴性ROS(如H2O2)的過量產生,這可能導致DUOX2的過度表達,加劇腸道中的氧化應激[23-24]。有趣的是,乳酸乳球菌會在炎癥部位釋放超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD),并通過高效利用SOD的抗氧化功能來清除ROS,緩解氧化應激損傷[25]。乳酸桿菌也似乎通過上調Nrf2依賴性抗氧化酶來緩解氧化應激損傷對疾病病程的影響。含氧結腸腔表面附近的糞腸球菌則是快速產生大量ROS,誘發氧化應激損傷[26]。與此不同,一些腸道菌群會響應上皮細胞的DNA損傷,通過巨噬細胞來促進NOS等生成更多的ROS,加劇腸道炎癥部位的氧化應激損傷[5,27]。

總之,腸道菌群保持穩態,正常發揮調節ROS產生、維持腸道內環境穩定和抗氧化防御的能力,對宿主胃腸道所處的健康和疾病狀態具有一定的決定作用。

4 自噬與氧化應激

當前,自噬主要分為微自噬、巨自噬和伴侶自噬三種不同形式,其在機體腸道生態調節、腸道穩態維持、適當的腸道免疫反應和抗微生物保護過程中起重要作用[28]。在多數條件下,氧化應激中過量積累的ROS都可作為調節因子,誘導自噬產生。反過來,自噬也能通過多種信號通路來清除被氧化應激損傷的線粒體和蛋白質等,減輕氧化應激造成的損傷,從而有效的保護細胞。

4.1 氧化應激誘導自噬產生機制

氧化應激可通過介導與自噬小體形成過程相關的信號通路來誘導自噬產生。大量研究結果表明,機體內過量的ROS可以通過抑制磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatiddy linositol-3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)信號通路來調節自噬的關鍵負調節因子哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR),從而誘導自噬產生[3,29]。在自噬體形成過程中,氧化應激可抑制自噬相關蛋白4(autophagy-related gene 4,ATG4)的活性,引起微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-assaiated protin 1 light chain 3,LC3-II)的積累,進而調節自噬。此外,氧化應激還可通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信號通路影響核轉錄因子kappa B(nuclear factor kappa B,NF-κB)、叉頭框轉錄因子O(Forkhead box O,FoxO)和轉錄因子激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)的活性,來調節自噬相關基因的表達水平[30]。

4.2 自噬緩解氧化應激的途徑

自噬主要通過多種途徑(如伴侶介導的自噬途徑、線粒體自噬途徑和p62傳遞途徑)清除蛋白質聚集體和受損細胞器(如線粒體等)的方式來緩解氧化應激損傷[31-32]。在氧化應激引起的某些反應中,Nrf2轉錄因子可以通過p62傳遞途徑來激發自噬體發揮清除氧化受損蛋白的功能,從而有效的緩解氧化應激損傷[33-34]。受損細胞器所生成的ROS,則可通過誘導線粒體自噬途徑去除受損細胞器的方式來降低ROS水平,緩解氧化應激損傷。

然而,在IBD病因學涉及的遺傳因素中,自噬相關基因的變異已經被鑒定[35]。自噬作用異常,使得自噬與氧化應激之間的某些相互作用丟失,從而發生腸上皮功能紊亂、腸道生物失調、Paneth細胞分泌抗菌肽缺陷、內質網應激反應和對病原菌的異常免疫反應,導致氧化應激損傷加劇[36]。

5 腸道纖維化與氧化應激

IBD引起的持續性腸道炎癥,會導致細胞外基質(extracellular matrix,ECM)蛋白過度沉積,誘發嚴重的腸道纖維化。大量研究[37-38]表明,慢性炎癥和TGF-β/ Smad信號在腸纖維化中起核心作用。值得注意的是,氧化應激介導了某些與慢性炎癥相關的纖維化,并且轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)和ROS也被證明與ECM的過度積累和腸道纖維化有關[39-40]。

在IBD中,TGF-β可促進ROS的生成并抑制抗氧化酶活性,導致機體原有氧化-抗氧化穩態的失衡,從而引起組織細胞的氧化應激損傷;反過來,ROS也可激活TGF-β并介導其參與多種纖維化效應,TGF-β與ROS相互交織形成惡性循環。TGF-β通過激活mTOR途徑的哺乳動物靶點以及Smad和Ras同系物/ Rho激酶(Ras homolog family mmember A/Rho-associated kinase,RhoA/ROCK)途徑來誘導NOX等增加ROS的產生[41-42]。此外,TGF-β還可通過降低抗氧化酶(如過氧化氫酶、GPX和SOD等)的表達,促進ROS水平的增加。相反,TGF-β的活性和表達受組織氧化還原狀態的調控。氧化還原失衡可增加TGF-β活性,誘導和上調TGF-β基因的表達[40]。此外,ROS還參與介導了TGF-β的纖維化效應,包括成纖維細胞激活、內皮細胞和上皮細胞凋亡以及纖維化和促纖維化基因表達等[42-43]。腸道纖維化與氧化應激的惡性交織,使得IBD不可逆的加重。

6 IBD氧化應激損傷的相關信號通路

除了大家所熟知的NF-κB信號通路和MAPKs信號通路外,通過大量文獻閱讀,我們總結出Nrf2信號通路、AMPK/FOXO信號通路、RAGE信號通路和SETD2信號通路等也參與了IBD氧化應激損傷。

6.1 Nrf2信號通路

在氧化應激及炎癥相關組織損傷中,對氧化還原敏感的Nrf2可通過抗氧化機制負性調節促炎反應和黏膜損傷,抑制IBD中ROS的過多生成來保護腸道黏膜免受氧化應激損傷,從而維持腸道黏膜穩態。

正常條件下,機體中的Nrf2可通過識別Keap1中的Cys來與Keap1結合形成二聚體,并以此來誘導自身泛素化降解,從而使得Nrf2處于低水平狀態,細胞趨于穩態。當受到外界環境ROS的氧化應激刺激時,Keap1中的Cys構象會發生改變,使Nrf2與Keap1無法結合或已結合的二聚體發生解離,導致Nrf2難以被泛素化降解,因此胞質中游離Nrf2逐漸增多。隨著Nrf2的增多,部分Nrf2進入細胞核內與抗氧化反應原件(antioxidant response element,ARE)相互作用,調控下游抗氧化酶[如血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)和谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase,GPX)等]及Ⅱ相解毒酶的表達,以提高機體的抗氧化能力,從而有效的去除過多生成的ROS,抑制氧化應激損傷[44]。

在慢性炎癥期間,持續的Nrf2激活對于機體抗氧化應激損傷至關重要。大量研究[7]表明,DSS誘導的Nrf2基因敲除小鼠結腸炎模型比常規野生型小鼠結腸炎模型的抗氧化酶表達水平明顯更低,也因此其表現出更嚴重的氧化應激損傷和腸炎癥狀,并伴有隱窩大量丟失。而在IBD病人腸道黏膜中,早期應答基因3(immediate early response-3,IER3)可通過PI3K/Akt途徑負調控Nrf2激活,使Nrf2會處于低水平,從而導致ROS產生增多,氧化應激損傷加劇[45]。所以,通過抑制IER3表達以及提高Nrf2激活水平,或許能夠提高機體抗氧化能力,減輕氧化應激損傷程度,緩解IBD。

6.2 AMPK/FOXO信號通路

AMP依賴的蛋白激酶[adenosine 5′-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK]本質上是一種由三個異質亞基組成的多基質蛋白激酶,包括一個催化α亞基和兩個調節β和γ亞基,其可作為維持細胞穩態的關鍵調節因子發揮作用。大量研究[46]表明,在多種應激反應中,AMPK均可充當應激傳感器發揮重要的調節作用,特別是在氧化應激反應中,AMPK途徑參與并激活抗氧化酶發揮其抗氧化作用,降低機體ROS水平,從而抑制氧化應激損傷。

ROS穩態調節的另一個關鍵介質是FoxO,FoxO家族的 FoxO1、FoxO3、FoxO4和 FoxO6均是AMPK下游調控的良好候選因子,因此在調節機體氧化應激反應中起著至關重要的作用[47-48]。先前的研究[49]已經報道,AMPK的激活可誘導FoxO3的核易位以及FoxO3與硫氧還蛋白-1(thioredoxin-1,Trx- 1)啟動子的結合。其中Trx-1是一種抗氧化蛋白,可以減少促炎細胞因子和ROS的生成,并增強機體的抗氧化防御能力,以此來降低機體ROS水平,緩解氧化應激損傷。所以,通過AMPK/FoxO信號通路可以上調Trx-1表達的抗氧化能力,減輕氧化應激損傷對IBD的影響。

6.3 RAGE信號通路

晚期糖基化終產物受體(receptor for advanced glycation end products,RAGE)是一種與炎癥反應和免疫系統激活有關的模式識別受體,其對多種分子都具有配體結合親和力,包括晚期糖基化終產物(advanced glycation end products,AGEs)、β-淀粉樣肽、高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)和S100等。其中,RAGE與AGEs結合后可介導NOX產生大量的ROS并在機體異常積累,誘發嚴重的氧化應激損傷。

氧化應激可通過激活原癌基因Ras編碼的p38Ras蛋白及MAPKs途徑激活NF-κB。NF-κB的活化可以刺激下游相關靶基因表達,如p21Ras、ERK以及RAGE的表達。這些促氧化基因的激活可使NO、IL-1、TNF-α、單核細胞克隆刺激因子等炎癥因子以及細胞間黏附分子等分泌增加[50]。大量炎癥因子、生長因子和黏附分子的表達釋放能觸發瀑布式炎癥反應,形成惡性循環,引起持續的細胞損傷和功能紊亂,最終導致組織損傷的發展。

許多研究表明,RAGE信號通路在正常人的腸道以及IBD病人腸道的非炎癥區域均處低表達狀態,然而,在IBD病人腸道炎癥區可觀察到RAGE信號通路表達增加,且與炎癥呈正相關。此外,RAGE信號通路相關配體可在氧化應激過程中生成增多,協助炎癥過程的持續和隨后的組織損傷[51]。所以,嘗試以RAGE為靶點,通過RAGE特異性抑制劑FPS-ZM1等抑制RAGE信號通路,控制氧化應激損傷的發生,可作為IBD潛在的新療法。

6.4 SETD2信號通路

含SET結構域蛋白2(SET domain-containing protein 2,SETD2)是組蛋白H3賴氨酸36(histone H3 lysine 36,H3K36)的三甲基轉移酶,它可以改變H3K36的三甲基化狀態并調節蛋白質結構及其功能[52-53]。SETD2是IECs生存所必需的,SETD2介導的H3K36me3可通過促進抗氧化基因[過氧化還原酶3(recombinant peroxiredoxin 3,Prdx3)]、Prdx6、谷氨酸-半胱氨酸連接酶修飾亞基基因(glutamate-cysteine ligase modifier,Gclm)和硫氧還原蛋白1(sulfiredoxin1,Srxn1)等)的表達來維持 ROS 穩態,抑制氧化應激損傷,從而防止腸道炎癥加劇,保護上皮屏障。

有研究[54]表明,SETD2表達水平降低與IBD發病機制之間存在潛在聯系。正常情況下,SETD2的表達水平與腸道炎癥正相關,然而,SETD2在IBD病人腸道組織中的表達水平顯著低于正常腸道組織中的表達水平。利用IBD臨床病人腸道組織樣本進行SETD2的表達量分析發現,與正常組織相比,SETD2在IBD臨床病人腸道組織中的表達水平顯著降低。因而在臨床上,SETD2缺失的IBD病人可表現為IECs凋亡和腸道黏膜屏障損傷增加,呈現出更嚴重的腸道炎癥反應,加劇IBD的發展。

實際上,IBD病人腸道上皮中的SETD2缺陷,可引起NF-κB和MAPKs等信號通路的異常激活,導致ROS積累,進而出現IECs凋亡和屏障破壞增強。上述結果表明SETD2可以作為IBD干預的潛在治療靶點,為與SETD2突變相關的IBD的臨床診斷和藥物研發提供重要的理論依據。

7 展望

IBD目前在臨床較常見,治療手段較保守,沒有特效方法根除。各種研究表明,ROS引起的氧化應激損傷是IBD重要的致病原因,圍繞氧化應激損傷及其相關信號通路展開更深入的研究,通過使腸道菌群紊亂正?；?、修復上皮屏障、改善氧化還原不平衡、調控機體自噬作用和腸道纖維化狀態等有效方法來抑制氧化應激損傷,或許在未來可以打開IBD診療的新局面,取得開拓性進展。