SPK、S1P蛋白在骨肉瘤中的表達及其臨床意義

張 武,王守朋,張兆川,褚宏章,王紹偉

(山東國欣頤養集團棗莊醫院 骨科,山東 棗莊 277100)

骨肉瘤為原發性惡性骨腫瘤,多發于兒童與青少年人群,以疼痛、腫脹、病理性骨折為主要臨床表現,由于其惡性程度高,侵襲性強,預后較差,病人術后5年生存率為65%～75%,骨肉瘤易發生轉移,以肺轉移為常見,發生轉移病人的5年生存率僅為20%,目前關于骨肉瘤的發病機制尚不十分清楚[1-2]。鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1,SPK1)是鞘脂代謝平衡的重要限速酶,可催化神經酰胺磷酸化形成1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P),SPK1具有癌基因特性,在腫瘤中高表達,并促進腫瘤惡性轉化[3]。呂冰潔等[4]研究表明,SPK1在小鼠肺癌細胞中高表達,抑制SPK1表達可通過Bcl-2/Bax途徑干擾肺癌細胞凋亡。SPK1與S1P形成SPK1/S1P通路,在調控腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移及耐藥性等過程中發揮重要作用[5]。目前SPK1、S1P在骨肉瘤組織中的研究尚未見報道。本研究通過檢測骨肉瘤組織中SPK1與S1P的表達情況,探討其與骨肉瘤發生發展的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年7月至2018年8月我院收治的73例骨肉瘤病人作為研究對象,手術取骨肉瘤組織,所選病人中男45例,女28例,年齡7～45歲。73例病人中,腫瘤直徑<5 cm者31例,≥5 cm者43例;發病部位為肢體55例,軀干部18例;骨母細胞型35例,軟骨母細胞型18例,纖維骨母細胞型20例;Eneeking分期Ⅰ期者29例,Ⅱ～Ⅲ期44例;有肺轉移者33例,無肺移者40例。納入標準:(1)經病理學檢查確診為骨肉瘤;(2)術前未行靶向治療、放化療或免疫治療;(3)病人臨床資料完整。排除合并其他惡性腫瘤病人。

選擇同期醫院進行手術的骨軟骨瘤手術切除標本31例作為對照,其中男18例,女13例,年齡8～46歲。本研究樣本采集均經過本院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑

SP免疫組化試劑盒及配套試劑、辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)標記山羊抗兔IgG購自北京索萊寶科技有限公司,兔抗人SPK1、S1P多克隆抗體購自Abcam公司。

1.3 免疫組織化學染色

手術過程中取得的骨肉瘤組織與軟骨瘤組織標本石蠟包埋,連續切片(約4 μm厚)后,使用二甲苯脫蠟,浸入EDTA溶液中微波抗原修復10 min,去離子水洗滌,使用3% H2O2溶液以滅活內源性過氧化物酶,加入兔抗人SPK1(1∶800)、S1P(1∶1 000)多克隆抗體,4 ℃冰箱孵育過夜后,PBS洗滌,加入HRP標記的IgG(按1∶1 000稀釋),室溫孵育1 h,PBS洗滌,DAB染色,蘇木素復染,梯度乙醇脫水,中性樹膠封片,用已知陽性骨肉瘤組織切片做陽性對照,PBS為一抗作為陰性對照,顯微鏡觀察。

染色結果判斷:SPK1、S1P陽性表現為棕色或黃色顆粒,主要定位于細胞質或細胞膜。

評分=染色強度評分×陽性細胞比例評分,陰性(-)0分,弱陽性1～4分,記為(+),陽性為5～8分,記為2+,強陽性為9～12分,記為3+。 細胞染色強度評分:無著色評0分、淡黃色評1分,棕黃色評2分,棕褐色評3分;陽性細胞比例評分:陽性細胞比例為0～5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%,分別評分為0、1、2、3、4分。

1.4 統計學方法

采用χ2檢驗和Kaplan-Meier生存曲線。

2 結果

2.1 骨肉瘤組織與軟骨瘤組織中SPK1及S1P表達水平比較

免疫組織化學染色結果顯示,SPK1、S1P主要定位于細胞膜或細胞質,骨肉瘤組織SPK1陽性表達率為68.49%,高于軟骨瘤組織中陽性表達率16.13%;骨肉瘤組織S1P陽性表達率為58.90%,高于軟骨瘤組織中陽性表達率22.58%,差異均有統計學意義(P<0.01)(見表1、圖1、2)。

表1 骨肉瘤組織與軟骨瘤組織中SPK1及S1P表達水平比較[n;百分率(%)]

2.2 SPK1、S1P與骨肉瘤臨床病理特征的關系

根據SPK1、S1P在骨肉瘤組織中表達陽性結果,將骨肉瘤病人分為SPK1陽性表達組50例和S1P陰性表達組23例,S1P陽性表達組43例和S1P陰性表達組30例。分析發現,SPK1、S1P在Eneeking分期為Ⅱ～Ⅲ期和肺轉移的病人中陽性表達率較高,差異均有統計學意義(P<0.05～P<0.01);SPK1、S1P在病人不同性別、年齡、腫瘤直徑、發病部位、病理類型的陽性表達率差異無統計學意義(P>0.05)(見表2)。

表2 SPK1、S1P與骨肉瘤臨床病理特征的關系[n;百分率(%)]

2.3 SPK1和S1P表達與骨肉瘤病人生存率關系的Kaplan-Meier生存分析

73例病人全部完成隨訪,27例因死亡而終止隨訪,通過Kaplan-Meier生存曲線分析可知,SPK1陽性表達病人3年生存率為38.50%,SPK1陰性表達病人3年生存率為74.17%,SPK1陽性表達組3年生存率低于SPK1陰性表達組(χ2=5.63,P<0.05);S1P陽性表達病人3年生存率為34.06%,S1P陰性表達病人3年生存率為77.44%,S1P陽性表達組3年生存率低于S1P陰性表達組(χ2=8.95,P<0.05)(見圖3)。

3 討論

骨肉瘤是一種惡性程度及自殘率極高的原發性腫瘤,其起病較為隱匿,早期發現比較困難,但進展快,多數病人確診時已到中晚期,10%～20%的病人確診時發生灶轉移,導致病人預后較差,5年生存率較低,因此研究骨肉瘤的發病機制,對骨肉瘤的早期診斷及治療具有重要臨床意義[6-7]。

細胞內鞘磷脂代謝如SPK1、S1P與細胞增殖、凋亡密切相關,在腫瘤的發生中發揮重要作用,SPKl是一種具有廣泛作用的細胞因子,對內皮細胞、軟骨細胞、腫瘤細胞等多種細胞具有調節作用,與細胞的凋亡、增殖和遷移密切相關[8-9]。既往研究表明,SPK1在胃癌、結腸癌、鼻咽癌、肝癌、白血病等多種腫瘤中均有研究[10-11]。研究[12]顯示,SPK1在骨肉瘤細胞中上調表達,與阿霉素耐藥有關,敲低或過表達SPK1可改變阿霉素耐藥性和細胞增殖活性。本研究結果顯示,骨肉瘤組織SPK1陽性表達率顯著高于軟骨瘤組織中陽性表達率,提示SPK1可能與骨肉瘤的發生有關。通過分析SPK1與骨肉瘤臨床病理特征相關性顯示,SPK1在Eneeking分期為Ⅱ～Ⅲ期和肺轉移的病人中陽性表達率較高,提示SPK1表達水平與骨肉瘤進展有關,與以往研究結果類似。蔡篤雄等[13]研究表明,胰腺癌中SPK1表達水平升高,SPK1的激活可促進胰腺癌細胞的增殖并抑制細胞的凋亡。推測SPK1可能通過促進骨肉瘤細胞增殖與轉移,進而促進骨肉瘤的發生發展。進一步分析發現,SPK1陽性表達組3年生存率低于SPK1陰性表達組病人,提示SPK1可能與骨肉瘤病人生存情況有關,提示SPK1可能作為評估骨肉瘤病人預后的生物標志物。

SPK1是細胞內合成S1P的主要限速酶,S1P是一種抗凋亡基因,可促進細胞增殖,S1P與其受體S1PR結合,在調控腫瘤細胞的增殖、遷移等過程中發揮重要作用[14]。宋娟等[15]研究表明,乳腺癌細胞中S1P激活可通過調節STAT3信號通路促進乳腺癌細胞增殖。而抑制S1P及其受體信號通路,可抑制肺腺癌細胞的遷移與侵襲[16]。本研究結果顯示,與軟骨瘤組織比較,S1P在骨肉瘤組織中陽性表達率顯著升高,提示S1P與骨肉瘤的發生發展過程有關。進一步分析結果顯示,骨肉瘤組織中S1P表達水平與Eneeking分期和肺轉移有關,提示S1P表達水平與骨肉瘤疾病進展有關。另外,本研究還顯示,S1P陽性表達組3年生存率低于S1P陰性表達組,提示S1P陽性表達病人可能生存率較低,與病人預后相關。

綜上所述,SPK1、S1P蛋白在骨肉瘤組織中高表達,且與骨肉瘤病人臨床病理特征和預后有關,可能作為骨肉瘤病人潛在的預后標志物。但由于本研究臨床樣本數據少,可能存在一定偏倚,將擴大樣本量作進一步研究。