外泌體在牙周再生應用的研究進展

黃欣悅 龔旭 郭維維 張滋彬 公梓昊 綜述 王忠山 審校

近幾年口腔流行病學調查顯示,牙周疾病以高達90%的患病率成為中國人群中最常見疾患之一[1]。牙周疾病不僅會導致牙槽骨的不可逆性吸收,影響咀嚼功能及美觀,降低生活質量[2],還和心血管疾病、2型糖尿病(T2DM)等全身系統性疾病相互影響[3-4]。牙周病現有治療包括牙周基礎治療、翻瓣手術、引導性骨再生,但僅能控制疾病進展,骨修復能力有限[5]。近年來,牙周組織再生成為牙周病治療研究中的熱點和挑戰。

外泌體是一類來源于核內體的小囊泡結構,直徑約30～160 nm,由細胞質中內涵體界膜向內凹陷形成管腔狀囊泡,經過組裝逐步具備動態亞細胞結構。當其運動至細胞膜后在信號分子指導下以外出芽方式形成顆粒狀小囊泡并釋放到細胞外環境[6]。Skotland 等[7]發現外泌體具有脂質雙層結構。此外還發現外泌體含多種母細胞源性生物學信息,既能清除細胞中多余或不必要物質,維持細胞內環境穩態,又能在細胞之間傳遞親本細胞的特異性物質[8]。

1 不同細胞來源外泌體

不同組織細胞來源的外泌體具有不同的生物學特征[9-10]。當組織出現損傷時,外泌體會被吸引到該區域,并釋放因子促進損傷組織增生分化和自我修復。

在口腔器官發育過程中上皮細胞(epithelium cells, ECs)和間充質細胞(mesenchyme cells, MSCs)會分泌外泌體,并擴散到基膜使得各細胞群及時進行信息交流,確保發育有序進行[11]。人脂肪間充質干細胞(human adipose mesenchymal stem cells, hASCs)分泌的外泌體(hASCs-Exos)可以調節切口創面的collagen type Ⅲ: type I、TGF-β3 : TGF-β1和MMP3∶TIMP1比例,加快皮膚創傷修復過程中的細胞外基質重建,減輕瘢痕形成[12]。國內趙彬等[13]將來源于5 名產婦的人羊膜上皮干細胞(human amniotic epithelial stem cells, hAECs)培養至第三代,通過成骨、成脂誘導分化后分成對照組和不同外泌體濃度的實驗組,發現100 μg/mL外泌體組大鼠皮膚組織創面膠原纖維排列更整齊。人骨髓源性基質細胞(human bone marrow derived stromal cells, hMSCs)是一類存在于哺乳動物骨髓基質中并具有極強分裂能力的細胞,可以在一定條件下分化成骨、軟骨、脂肪、神經等組織[14]。hMSCs分泌的外泌體(hMSCs-Exos)可以促進牙周膜細胞的增殖和克隆,并能促進其成骨作用。有學者將hMSCs和人牙髓干細胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)分泌外泌體(hDPSCs-Exos)分別與基質蛋白結合,來探索不同干細胞來源外泌體在牙髓再生工程中的應用效果,發現不同細胞來源的外泌體具有不同的誘導干細胞特異性分化的潛力,提示在應用于牙髓、牙周再生前應考慮外泌體供體細胞來源和狀態的重要性[15]。費棟棟等[16]通過有限稀釋法篩選成骨強的人牙周膜干細胞亞系(human periodontal ligament stem cells, hPDLSCs),其產生的外泌體通過誘導靶細胞組蛋白H3、 H4乙?；降母淖冞M而影響組蛋白乙酰轉移酶的表達,對靶細胞(hPDLSCs)成骨分化進行調控。

近年來也有不少研究發現,不同種類干細胞來源外泌體聯合應用可以得到更好的治療效果。 Narayanan等[17]聯合使用成骨細胞來源外泌體(osteoblasts-derived exosomes, Os-Exos)和脂肪細胞來源外泌體(adipocytes-derived exosomes, Ad-Exos),發現可以在較早分化時間點開啟譜系特異性基因的表達。

但是,當前想要獲得高純度外泌體仍有一定困難,可以參考國際細胞外囊泡協會提出的指南,結合新的實驗技術和方法來獲取外泌體。用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)對牙囊細胞(dental folic cells, DFCs)來源外泌體(DFCs-Exos)進行預處理,探索不同濃度DFCs-Exos對牙周炎患者成骨能力的影響。最后發現100 μg/mL DFCs-Exos 組PDLSCs成骨分化能力較強,更有利于促進牙周組織再生[18]。 Yang等[19]發現經過根尖牙胚細胞培養液(APTG-CM)誘導的PDLSCs可以向牙骨質、牙周韌帶樣組織分化。由此說明APTG-CM能夠提供一個成骨水泥的微環境,并誘導PDLSCs向成骨細胞譜系分化。

目前將外泌體應用于牙周再生的相關報道和可靠數據較少,但是聯合應用組織工程技術,將某種具有特定功能的外泌體移植到牙周缺損處,以此促進相關組織的誘導發生、成熟和神經血管再生,得到了初步的證實。

2 外泌體分泌的活性物質

外泌體通過釋放蛋白質、RNA等活性物質,對機體生命活動進行調節。Valadi 等[20]發現肥大細胞系(mast cells-MCs)來源外泌體(MCs-Exos)內含有mRNA和microRNA,它們在不同物種細胞之間相互傳遞,并在新位置發揮功能。劉世宇等研究hMSCs-Exos 對hPDLSCs 增殖和分化功能的影響,分別檢測實驗組(用hMSCs-Exos處理hPDLSCs)和對照組hPDLSCs的成骨相關基因表達(Runx2、OCN、ALP、BSP、Col-Ⅰ)的增殖速率及其克隆能力,結果顯示實驗組顯著高于對照組[21]。炎癥會增加PDSLCs的外泌體分泌,并促進人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vascular endothelial cells, HUVECs)的血管生成,而阻斷外泌體的分泌會導致HUVECs血管生成的退化。外泌體分泌的血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)被證明是PDLSCs和HUVECs之間的關鍵信號分子[22-23]。

隨著研究不斷深入,各種活性物質的種類、功能屬性和作用機制將有可能被更好地了解和掌握,未來或許可以實現含有特異性活性物質的外泌體的批量生產,對病損牙周組織進行個性化修復,造福牙周病患者。

3 工程化外泌體的應用

基于外泌體的分子運輸能力以及靶向特性,通過對外泌體表面分子的修飾改造賦予其細胞和組織特異性(靶向修飾),而通過在供體細胞內共表達蛋白質/RNA轉運物也可以將特定的蛋白/RNA分子裝載到外泌體中(目的分子裝載)。工程化外泌體具有高產量、高靶向效率、高目的蛋白/RNA裝載效率等多重作用[24]。

將細胞療法應用于牙周炎等炎癥相關疾病在實驗階段已經取得一定進展。Xu等[25]研究發現經P2X7受體(P2X7R)基因修飾的干細胞來源外泌體分泌miR-3679-5p、 miR-6515-5p、 miR-6747-5p,這些物質與GREM-1蛋白結合,逆轉炎癥介導的PDLSCs損傷?？梢圆捎脭D壓方法從hMSCs中積累外泌體模擬物(exosome mimetics, EMs),與hMSCs來源的外泌體相比,收集到的EMs產量顯著提高。通過轉染noggin shRNA進一步下調天然骨形態發生蛋白(BMP2)拮抗劑noggin的表達以增強EMs的成骨特性[26]。Exo-181b通過抑制PRKCD和激活p-AKT顯著增強M2型巨噬細胞極化,抑制炎癥及增強骨整合。此外,還證實了增強的M2型巨噬細胞極化可通過體外分泌VEGF和BMP-2間接促進骨遷移和成骨分化[27]。

外泌體的工程化改造是賦予其新特性的便捷方法,隨著研究的不斷進展,相信將來可以攻克這一難關。

4 外泌體與復合支架材料的聯合應用

研究者發現,單獨將外泌體定植在病損牙周組織,新生細胞會受到生長空間和生存環境限制,修復效果欠佳。生物相容性復合材料可以作為支架有效引導修復組織在空間合理分布,并提供生理性牙周環境,有利于細胞增殖。將牙釉質基質蛋白衍生物和骨生長素分別與膠原海綿(absorbable collagen sponge, ACS)聯合使用,發現兩組都形成新的結締組織附著和新骨,說明ACS可作為牙周愈合實驗理想支架材料[28]。ACS具有放射透明性、相對惰性和可吸收性。在大鼠牙周缺損模型中,植入帶有間充質基質細胞(mesenchymal stromal cells, MSCs)培養基(MSC-CM)的ACS,發現缺損處骨和血管生成相關基因的表達水平顯著上調[29]。此外, Li 等[30]將hASCs-Exos固定在聚多巴胺涂層的聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA/pDA)支架上,構建出一種新型無細胞組織工程骨,來誘導成骨作用。后發現外泌體從PLGA/pDA支架緩慢釋放,顯著增加了骨再生效率。上述無細胞系統為如何治療缺失牙槽骨提供了新的思路。 Shen等[31]發現將hDPSCs-Exos和殼聚糖水凝膠(chitosan hydrogel, CS)結合形成的(hDPSCs-Exos/CS)可以促進小鼠牙周炎區域的巨噬細胞由促炎表型向抗炎表型轉化。提示或許可以利用CS結合外泌體來抑制牙周炎癥和調節免疫應答,改善牙周損傷。值得重視的是, Liu等[32]首次系統綜述了干細胞、 3D打印、基因治療和分層生物結構技術,應用于牙周(牙槽骨-牙周韌帶-牙骨質復合體)再生方面的新進展。實驗先通過細胞歸巢避免倫理問題和防止免疫排斥反應;其次, 3D打印可以使牙周膜纖維具有定制的仿生結構和生物活性成分;基因治療還可以精準靶向調控缺損微環境,具有分別促進牙骨質、牙周韌帶纖維、牙槽骨再生的功能;最后通過分層設計材料實現牙周組織完整、同步再生。除了細胞歸巢、基因治療和層狀材料用于牙周再生的研究仍處于實驗室研究階段,其他的治療材料已經被批準用于臨床治療。這個實驗為如何同步恢復喪失的牙周組織提供了極好的設想。在巨噬細胞模擬的炎癥環境中,用Ag離子和MSCs-Exos修飾PCL支架,發現該支架顯著降低了促炎基因的表達和減少了IL-6、 TNF-α的分泌,并促進hBMSCs成骨分化[33]。近年來,負載有外泌體的β-TCP復合支架也在逐漸推廣。

這些研究成果為外泌體和生物相容性復合支架材料聯合應用奠定了基礎。

5 外泌體在牙周再生治療中的新功能展望

基因療法有望從分子層面更精準有效地直接治療疾病。在這里我們綜述了在基因水平對外泌體進行操作,進而運用于臨床中牙周再生治療的可能性。

基因治療可以將干細胞及其衍生物變成靶向基因的載體,引導人體疾患朝著糾正、組織修復和再生的目標發展[34]。規律間隔成簇短回文重復序列/規律間隔成簇短回文重復序列相關蛋白系統(CRISPR/Cas)是存在于細菌與古菌的一種防御機制,目前在基因組研究領域得到廣泛應用[35-36]。 Lin等[37]研制出一種外泌體脂質體雜交納米顆粒,用于傳遞CRISPR/Cas系統。負載的混合外泌體可以被MSCs內吞并釋放該系統,從而調控MSCs中靶向基因的表達。在未來,我們是否可以利用外泌體,將攜帶糾正牙周炎癥相關基因的CRISPR/Cas系統導入干細胞用以介導牙周組織修復,值得探索。

大量研究表明,在炎癥微環境中PDLSCs的免疫調節能力和再生潛能會受到損傷[38],進而降低移植干細胞治療效果[39]。P2X7R表達于大多數干細胞,在炎癥反應中發揮廣泛的生理和病理作用[40]。 Xu等[41]通過實驗發現炎癥條件會降低PDLSCs中P2X7R表達,而通過BzATP激活P2X7R或通過基因轉導過表達P2X7R,可以逆轉炎癥介導的牙槽骨進行性吸收;此外,該團隊又發現PI3K-AKT-mTOR通路與牙槽骨成骨過程相關。當干細胞及其衍生物移植到牙周炎區域,它們功能會受到影響,導致干細胞療法用于牙周再生的臨床應用進展緩慢;為了探究P2X7R基因對周圍環境的影響,將經過P2X7R基因修飾的干細胞條件培養基(CM-Ad-P2X7)與外泌體(ex-ad-p2x7)聯合用于孵育PDLSCs。發現在炎癥微環境下, ex-ad-p2x7通過修改不利的局部微環境使PDLSCs脫離功能障礙。在牙周再生過程中使用ex-ad-p2x7,不僅提高干細胞治療的安全性和有效性,還不會引起副作用,為牙周炎的臨床治療提供了一種可行而有前景的方法。當然,還需要更多的體內實驗來驗證P2X7R對組織再生的積極影響及其安全性[25]。

簡而言之,將來可以將基因分子技術和外泌體相結合,在未來有望使牙周炎得到更精準有效的治療。

綜上所述,越來越多證據表明外泌體在牙周再生中發揮著十分重要的作用。近年來,外泌體對牙周炎等口腔疾病的治療作用也受到較高關注,這也提供了更全面的研究資料[42]。此外,含有多種生物活性分子的外泌體顯示出巨大的潛力,這些分子不僅可以用于臨床治療,還可用于協助臨床診斷和評估預后等整個疾病的全過程。本文基于不同細胞來源的外泌體及其種類、其所分泌的活性物質、應用的新技術和新方法和未來研究方向等作了相關的討論。目前基于外泌體用于牙周再生的研究水平仍然不夠成熟,距離將理論轉化為實際運用于臨床還有很漫長的路要走。值得注意的是,外泌體的優勢已日益顯著。在未來的牙周再生領域,將外泌體與基因分子技術結合,是一個新的趨勢。