轉基因檢測標準的方法驗證工作研究

章寅，賈軍偉，白藍，陳一帆，阮功成，呂貝貝*，潘愛虎*

1.上海市農業科學院生物技術研究所，上海市農業遺傳育種重點實驗室；農業農村部農業轉基因生物安全評價（環境）重點實驗室；農業農村部農作物生態環境安全監督檢驗測試中心（上海），上海 201106；2.越南北江農林大學，越南 北江 21000

轉基因技術屬于基因工程領域的遺傳轉化技術，是現代農業育種技術的核心技術［1］，它通過打破物種間的界限，從而實現作物目標性狀的定向改變，在緩解資源約束、減少生態環境污染、改進農產品質量、節水增效、拓展農業功能等方面顯示出重要作用和巨大潛力［2］，農業轉基因技術已成為世界各國增強農業核心競爭力的戰略選擇［3］。

發展轉基因是我國農業的重大戰略決策。2020 年2 月26 日，農業農村部辦公廳印發關于《2020 年農業農村科教環能工作要點》的通知中提到，組織實施轉基因生物新品種培育重大專項，進一步強化生物育種技術研究和產品熟化。轉基因將成為保障我國糧食安全、實現種業振興的重要手段之一。轉基因檢測標準能為轉基因食品的有效標識、科學監管、推廣應用提供重要的技術支撐。詳細有效的轉基因標準方法驗證指南將為我國轉基因標準體系的應用推廣提供參考和技術指導。

1 轉基因檢測標準體系

轉基因檢測標準是農業轉基因生物安全管理必不可少的技術保障［4-7］。在《農業轉基因生物安全管理條例》《農業轉基因生物安全評價管理辦法》等配套管理辦法的指導下，農業農村部和國家質量監督檢驗檢疫總局等相關部門組織制定了轉基因生物安全檢測標準體系框架和標準修制訂規劃［4，8-9］。

現有標準中覆蓋了大豆、水稻、玉米、油菜、棉花、小麥、苜蓿、甜菜、番茄等轉基因作物，以及常用的抗病毒、抗蟲及耐除草劑基因、報告基因、內標準基因等檢測項目［10］。檢測標準在被相應的實驗室使用之前，需要實驗室按照《ISO/IEC17025：2017 檢測和校準實驗室能力的通用要求》或《CNAS-CL01：2018 檢測和校準實驗室能力認可準則》的要求開展方法驗證工作，證實實驗室具備進行轉基因準確檢測的能力。但是上述兩項標準只給出了方法驗證的定義，并沒有具體開展的操作指南，同時現有的文獻中關于轉基因檢測方法的驗證缺少科學性、有效性的參考依據，故對于開展轉基因檢測標準的方法驗證分析研究有迫切的需求。

2 轉基因檢測標準方法驗證的關鍵點

2.1 儀器設備檢定校準

轉基因檢測數據一部分主要依靠儀器設備直接獲得，因此儀器設備的狀態對檢測結果有著直接的影響。開展標準方法驗證之前需要確認儀器設備的靈敏度、準確度、穩定性是否滿足要求。

轉基因檢測實驗室主要以出具定性結果為主，對儀器設備的性能指標更加重視。關鍵設備如定性PCR 儀、實時熒光PCR 儀、凝膠成像系統等目前缺乏檢定或校準規程，故無法送至計量檢定部門進行檢定或校準，實驗室可以參加農業農村部組織的儀器比對或周期性地開展內部校準和功能性檢查。其他關鍵設備如電子天平、移液器等則需送至計量檢定部門檢定或校準。

2.2 關鍵試劑及標準物質驗收

針對轉基因定量檢測標準［11］，標準物質樣品是檢測結果可比、有效和可溯源的重要保障。檢測標準要求在驗證工作開始前，需準備相對應的標準物質樣品［12］。目前，有資質研制轉基因標準物質的單位/機構包括美國油脂化學家學會、歐盟聯合研究中心、中國農業農村部科技發展中心等［13］。標準物質也分為基體標準物質、基因組DNA 和質粒DNA 標準物質［14-16］。方法驗證時需要根據實際的樣品種類、含量以及形態特征選擇合適的標準物質。通過標準物質的測定值來核實標準驗證的有效性和準確性［17］。

除了標準物質，DNA 提取試劑盒、DNA 聚合酶、引物、探針、PCR 反應緩沖液等也是轉基因檢測中的關鍵試劑耗材，標準驗證過程中需要對其進行嚴格的驗收，并做好驗收記錄。

2.3 技術參數驗證

精密度、線性范圍、檢出限和定量限是標準驗證中需要進行有效驗證的特性參數，上述指標在食品理化檢測標準中有詳細的操作步驟和技術要求，轉基因檢測屬于分子生物學檢測范疇，缺少此類的驗證技術指導。國際上進行轉基因檢測方法驗證的研究可參考歐盟聯合研究中心的權威指南文件《Verification of analytical methods for GMO testing when implementing interlaboratory validated methods》（EUR 24790 EN，JRC）。上述指南中規定，準確度驗證至少選擇包括接近定量限在內的3 個不同濃度水平進行驗證，每個濃度水平要得到16 個PCR平行結果，平均值通過一定的計算公式計算，結果應在可接受參考值的±25%內。重復性驗證主要通過PCR 平行試驗進行評估，選取5%、1%、0.5%、0.1%這4 個不同轉基因含量的樣品進行檢測，每個水平至少要得到16個獨立測量結果，計算得到相對可重復性標準差，要求結果應在可接受參考值的±25%內。定量限的驗證用一個低轉基因濃度的陽性對照樣品的至少10次PCR平行重復來測量，如果所有的平行重復結果都是陽性，這表示實驗室的定量限低于或等于該標準中設定的陽性對照水平［18-19］。

2.4 環境區域隔離

在開展驗證之前，需要保證實驗環境未被污染。轉基因檢測主要針對DNA、蛋白質等生物大分子，檢測方法又具有高靈敏性，實驗室需要重點考慮氣溶膠污染和交叉污染。因此日常實驗室需要有效分區，檢測區和實驗室要隔離，可設置為試劑準備區、樣本準備區、擴增區、產物檢測區等。對空調、生物安全柜等設施定期保養維護。有條件的實驗室安裝空氣過濾系統，并時常進行房間通風，定期進行紫外線照射，有效控制氣溶膠對標準方法驗證的影響［20-21］。

3 轉基因檢測標準方法驗證工作建議

3.1 積極參加能力驗證工作

實驗室內自身開展的轉基因方法驗證工作屬于內部質量控制方法的一種，能有效監控實驗室在技術能力、資源配置、體系保證等方面的符合程度，但該方法無法有效消除實驗室內誤差，而參加能力驗證則可以很好地解決這一問題。通過參加權威能力驗證單位組織的驗證工作，轉基因檢測實驗室可直觀判定本實驗室檢測結果的準確性，及時識別出實驗室存在的質量問題，從而更好地評價轉基因標準方法驗證工作。

3.2 注重積累定量檢測方法驗證經驗

現有的轉基因標準以定性檢測為主，在方法驗證過程中缺乏對數據定量結果的驗證工作。隨著轉基因標識制度在中國及國際上的不斷推行，很多國家不僅要求對轉基因食品進行定性檢測，更加會對定量檢測提出需求，故轉基因檢測實驗室需要加強對檢測數據真實性、準確性等方面的驗證工作，同時要對數字PCR 等一系列定量檢測儀器的計量校準工作提前準備。國外轉基因含量標識的閾值一般在0.9%～5%之間［22］，標準方法在驗證過程中要更加注重這幾個點的驗證工作，有條件時還需要完成不確定度的評價工作，以便為標準方法的驗證工作提供更加全面完善的信息。

3.3 拓展標準物質的日常質量控制

轉基因檢測過程中，要同時設置陰性對照、空白對照和陽性對照，以此來確保實驗過程的可塑性和可比性，故實驗室要將標準物質納入到日常的質量控制中。標準物質可以購買大豆、玉米、油菜等作物特定品系的陽性標準物質，也可以購買目前研究比較熱門的陽性標準質粒分子。已有報道將包括CaMV35S 啟動子、NOS 終止子在內的8 個調控原件轉化到質粒上，形成陽性標準質粒分子，可用于轉基因成分的檢測與研究。該方法不僅能減少陽性物質的反復提取，降低污染，同時能覆蓋大多數轉化體，提高檢測的覆蓋面。

3.4 探索引入國際GLP質量管理準則

良好實驗室規范（good laboratory practice，GLP），作為一種國際認可的實驗室質量管理體系，常被應用于醫藥、食品等重要領域的非臨床安全性評價試驗中。轉基因檢測數據成為監管部門作出行政審批的技術依據，直接關系著我國轉基因技術未來的發展方向，世界上美國、歐盟等發達國家均已將其應用于轉基因生物領域。在將來的轉基因標準方法驗證工作中，可以探索引入GLP 準則中的質量要求，從而更好保障數據的真實性和可追溯性，以期為轉基因生物安全管理、研發和產業發展提供借鑒。

4 展望

轉基因檢測技術標準是保證我國轉基因生物安全管理制度順利實施的重要技術支撐，隨著我國生物育種產業化的推進，轉基因作物的商業化種植和轉基因研發新技術的不斷發展，轉基因研究試驗、生產加工、進出口和標簽標識等方面的監管任務劇增，我國必然需要增加轉基因檢測的技術力量。建立一套詳細、嚴謹的轉基因標準方法驗證標準規程，保障檢測結果的真實性、準確性、可比性和溯源性，有利于各家機構統一化、高標準地開展方法驗證工作，同時便于監管機構開展對檢測機構的評審考核工作，進一步提高轉基因檢測體系的能力水平，促進我國轉基因檢測水平與國際對標，為我國農業生物安全監管工作提供堅強的技術支撐。未來轉基因標準方法驗證規程需要具備以下幾方面的要求。

首先，驗證規程需要適用多類型機構。轉基因監管的檢測機構數量需要進一步增加，除了部級質檢機構、出入境檢驗檢疫機構等政府實驗室，還應將社會實驗室補充進入轉基因政府監管工作中。這些機構在建設布局、條件水平、質量體系、運行模式，檢測能力等方面存在巨大差異，而轉基因檢測工作很敏感，公眾關注度高，檢測數據的真實性要求高。驗證規程要適用大部分的轉基因檢測實驗室，以同一尺度開展驗證工作，從儀器設備檢定校準、關鍵試劑及標準物質驗收、技術參數驗證、環境區域隔離等關鍵參數開展驗證工作。

其次，驗證規程需適用于新型標準物質。轉基因檢測標準物質作為實物標準，對支撐轉基因檢測工作的開展、數據的準確性、有效性和可追溯性具有重要意義。國務院印發的《計量發展規劃（2021—2035 年）》要求“建立完善以國家基準物質、國家標準物質和工作標準物質為主要組成部分的標準物質體系”，要求加快重點領域的標準物質研制和應用。隨著農業農村部轉基因重大專項“基因檢測標準物質研制”等項目的實施，我國已經具備研發轉基因定量檢測標準物質的能力［23］。未來除了現有的基體標準物質、基因組標準物質，新型的質粒標準物質也將成為方法驗證中重要的標準物質［24］，其具有制備靈活、不受樣品影響、性質簡單、可操作性強等優點，將成為轉基因檢測標準方法驗證重要的技術材料。

最后，驗證規程需適應新型檢測標準。目前，國內轉基因標準體系中的主流技術為普通PCR，將來隨著轉基因作物分子特征分析、精準定量、標準物質定值等工作的開展，精準定量、快速檢測技術、高通量檢測技術、基因編輯產品檢測標準數量將增加［25-26］，實驗室需要做好相應的標準技術和標準能力的儲備工作。