新煙堿殺蟲劑噻蟲嗪免疫學特性研究

李廣領,李新安,李金麗,肖娜娜,趙亞娟,陳錫嶺（河南科技學院,河南新鄉453003）

新煙堿殺蟲劑噻蟲嗪免疫學特性研究

李廣領,李新安,李金麗,肖娜娜,趙亞娟,陳錫嶺
（河南科技學院,河南新鄉453003）

通過化學修飾合成了噻蟲嗪（thiamethoxam,TMX）人工半抗原,采用碳二亞胺法（EDC）將該抗原與牛血清蛋白和卵清蛋白偶聯成功制備了分子結合比合理的免疫抗原（TMX-BSA）和包被抗原（TMX-OVA）.對經TMX-BSA免疫的6周齡Balb/c實驗鼠的免疫抗血清進行了間接ELISA和阻斷ELISA,初步明確了抗噻蟲嗪多克隆抗體（TMX-pAb）的免疫學特性,為噻蟲嗪殘留免疫學快速檢測技術開發和檢測產品研制奠定了堅實基礎.

噻蟲嗪；單克隆抗體；殘留；酶聯免疫吸附測定法

噻蟲嗪（thiamethoxam,TMX）是諾華公司于1991年成功開發的第二代新煙堿類殺蟲劑.從結構看,它以2-氯-5-噻唑基和甲基作為藥效基團,是對惡二嗪先導化合物最理想的修飾結合；從作用靶標看,它作用于昆蟲煙堿型乙酰膽堿受體（nAChR）,干擾昆蟲中樞神經系統的信號傳導,導致害蟲麻痹死亡,作用方式新穎[1-2]；從殺蟲活性看,它有比第一代新煙堿殺蟲劑更強的觸殺、胃毒和內吸活性,而且其在植物體內降解速度相對較慢,因而,它不僅可用作葉面噴霧,還可以進行土壤處理和種子處理[3]；從殺蟲譜看,它對幾乎所有咀嚼式口器害蟲和絕大多數刺吸式口器害蟲都有優良防效,尤其是在控制對常規有機磷、氨基甲酸酯和擬除蟲菊酯殺蟲劑產生抗性的害蟲方面優勢非常突出；從安全性看,它對哺乳動物低毒,無致畸、致突變效應[4].基于噻蟲嗪以上特點,近年來它在農業生產上被大量、廣泛應用,但靶標昆蟲的抗藥性[5-8]、在農產品中的高水平殘留問題隨之出現.關于農產品和環境樣品中噻蟲嗪殘留測定方法已有報道,其中最常用的是色譜法[9-13],隨著小分子藥物免疫檢測技術的不斷發展和完善,其篩查能力強、檢測快速、成本低廉的檢測特性受到廣泛關注[14-15].根據藥物免疫分析的基本原理和要求,基于噻蟲嗪的小分子特性,通過化學修飾改變其分子結構,再與大分子載體共價偶聯,制備其完全抗原,通過免疫實驗動物產生針對該農藥的特異性抗體,旨在為噻蟲嗪殘留免疫學快速檢測技術開發提供理論依據和技術支持.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

DU-800型UV-vis（Beckman公司）、LCQDeca XPMAX型HPLC-MS（Finnigan公司）、TENSOR27型IR（Bruker公司）、Gene Quant Pro型核酸蛋白含量測定儀（英國Amersham Biosciences公司）、VARIOSKAN FLASH型酶標分析儀（Thermo公司）等.

吡蟲啉（imidacloprid）、啶蟲脒（acetamiprid）、噻蟲啉（thiacloprid）、噻蟲胺（lothianidin）標準品,購于國家標準物質研究中心；95%的噻蟲嗪原藥,上海諾泰化工有限公司產品；β-巰基丙酸、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、碳二亞胺（EDC）、牛血清蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）、羊抗鼠IgG-HRP、RPMI-1640、HAT、PEG-1500,均為Sigma公司產品.

2.2 試驗動物

6周齡SPF級雌性Balb/c實驗小白鼠,購于鄭州大學實驗動物中心,室驗室飼養.

2.3 試驗方法

2.3.1 人工半抗原和完全抗原的制備與結構鑒定利用β-巰基丙酸與TMX的縮合反應制備TMX人工半抗原.具體方法為：用20mLDMSO在250mL燒瓶中溶解5.8 g噻蟲嗪原藥,加入2.25 g KOH,攪拌下將β-巰基丙酸溶液（2.1 gβ-巰基丙酸溶解于10mLDMSO）用恒壓漏斗緩慢滴加至反應燒瓶,于100℃油浴下反應2 h,待產物自然冷卻至室溫后,加入50mL水,以6mol/L的鹽酸調節反應液pH為3.將此混合液轉移至分液漏斗,用90mL二氯甲烷分3次萃取,收集有機相.用75mL 1mol/L的NaHCO3水溶液分3次洗滌二氯甲烷提取液,收集水相.再用6mol/L的鹽酸調節水相pH為3,然后用90mL乙酸乙酯分3次提取水相,合并乙酸乙酯提取液.提取液經無水硫酸鈉干燥和減壓濃縮,得黃色粘稠液體.加入少量丙酮溶解,靜置過夜,有黃色結晶析出,過濾得目標化合物.噻蟲嗪人工半抗原合成路線見圖1.

圖1 TMX人工半抗原的合成路線

采用EDC兩步法合成免疫抗原（Hapten-BSA）和包被抗原（Hapten-OVA）.具體方法為：將14.7mg/mL合成的噻蟲嗪人工半抗原與20mg/mLBSA的PBS溶液混合,室溫下低速震蕩過夜,再以3 000 rpm離心5min,棄去沉淀,在上清液中加入2mLNHS作保護劑,然后逐滴加入5mg/mLEDC水溶液,繼續振蕩5 h,再以3 000 rpm離心5min,上清液用PBS連續透析3 d,其間每隔8 h更換新鮮透析液,透析完畢后分裝,即得免疫抗原（Hapten-BSA）,于-20℃下保存備用.再將BSA換為OVA,采用與TMX-BSA合成相同的步驟合成包被抗原（Hapten-OVA）,供包被酶標板之用.噻蟲嗪免疫抗原和包被抗原的合成路線見圖2.

圖2 TMX完全抗原的合成路線

以HPLC分離TMX半抗原并用MS鑒定其合成情況,用IR、UV掃描其半抗原、完全抗原和載體蛋白（BSA）,確定半抗原與載體蛋白的偶連情況.參考王俊東等[16]方法,測定并計算TMX完全抗原與載體蛋白的偶聯比,根據“結合比=[（ε偶連物-ε載體蛋白）/ε半抗原]”計算半抗原與載體蛋白的結合比.

2.3.2 噻蟲嗪免疫學特性鑒定以TMX-BSA 50μg·0.2mL/只的免疫劑量,對5只實驗鼠背部皮下多點免疫,加強免疫于首次免疫后4周進行,共進行4次,各次免疫間隔期均為3周.末次加強免疫后10 d,斷尾采血測抗體效價[17]、抗體對噻蟲嗪的抑制效果和對噻蟲嗪結構類似物的交叉反應情況.

2 結果與分析

3.1 噻蟲嗪人工半抗原、完全抗原的結構鑒定

3.1.1 半抗原的MS鑒定以HPLC分離和MSD檢測到的噻蟲嗪人工半抗原的ESI-MS見圖3.

圖3 噻蟲嗪人工半抗原的ESI-MS

結合有機化合物氮規則,由圖3中不同碎片離子的相應m/z知,相對豐度約為50%的m/z為376.68的碎片離子峰應為合成半抗原的分子離子峰[M+1]；m/z為329.67的碎片離子峰為基峰,對應于合成半抗原分子失去NO2產生的碎片離子；同時譜圖中m/z為61.19、87.22、120.82、161.01、256.93和359.15等碎片離子峰與噻蟲嗪人工半抗原分子不同裂解碎片均具有合理的歸屬關系,表明噻蟲嗪人工半抗原合成成功.

3.1.2 完全抗原的IR鑒定合成半抗原、載體蛋白（BSA/OVA）和完全抗原的IR見圖4.

圖4 半抗原、載體蛋白和完全抗原的IR

由圖4可見,載體蛋白與免疫抗原（Hapten-BSA）和包被抗原（Hapten-OVA）在3 300～3 500 cm-1和1 500～1 700 cm-1范圍內吸收特征極為相似,這是BSA/OVA中氨基酸的特征吸收,說明所合成完全抗原中具有載體蛋白的特征官能團；另外,Hapten-BSA、Hapten-OVA的IR與半抗原的IR在800～1 300 cm-1之間,還出現了類似的半抗原的特征吸收,其中1 200～1 400 cm-1為TMX藥效基團的硝基和甲基,而BSA和OVA在該波數附近無吸收,說明TMX完全抗原中具有半抗原的特征官能團,據此可以判定TMX半抗原與BSA/OVA偶聯成功,即免疫抗原和包被抗原合成成功.

3.1.3 完全抗原的SDS-PAGE鑒定合成免疫抗原（Hapten-BSA）和包被抗原（Hapten-OVA）的SDS-PAGE見圖5.

圖5 TMX免疫抗原和包被抗原的SDS-PAGE

由圖5可見,Hapten-BSA和Hapten-OVA的電泳譜帶與所用Marker中BSA和OVA的譜帶完全對應,說明所制備免疫抗原與包被抗原分別成功偶連了BSA和OVA.

3.1.4 完全抗原的UV鑒定噻蟲嗪人工半抗原、載體蛋白（BSA、OVA）免疫抗原和包被抗原的UV見圖6.

圖6 TMX人工半抗原、免疫抗原與載體蛋白（BSA）的UV

由圖6紫外掃描圖譜可見,半抗原和載體蛋白的最大吸收峰分別位于257 nm和278 nm；而偶聯物（Hapten-BSA和Hapten-OVA）的最大吸收峰介于275～278 nm之間,說明半抗原與載體蛋白偶聯成功.根據半抗原、載體蛋白和偶連物的OD280,計算它們在280 nm下的摩爾吸光系數,按1.3.1中偶連率估算公式,算得半抗原與BSA的分子結合比為23.5︰1,半抗原與OVA的分子結合比為16.7︰1.另用核酸蛋白含量測定儀測得Hapten-BSA蛋白含量為11.96mg/mL,Hapten-OVA蛋白含量為8.05mg/mL.

3.2 抗血清效價測定

以5μg/mL的TMX-OVA包板和1︰1 000倍鼠陰性血清、1︰1 000倍RaMIgG-HRP按1.3.3效價測定方法測得不同稀釋倍數多抗血清（TMX-pAb）的效價,結果見表1.

表1 間接ELISA檢測TMX-pAb的OD450

由表1中標記“*”的OD450可以看出,用所制備TMX-BSA免疫的5只實驗鼠均產生了較高效價的TMX-pAb,說明既定免疫劑量、免疫方式和免疫程序切實可行.其中1號免疫鼠和3號免疫鼠的抗血清效價最高,均達到了1︰2.56×104；其次為4號和5號免疫鼠,它們的抗血清效價為1︰1.28×104,抗血清效價最低的2號免疫鼠,也達到了1︰6.4×103.

TMX-pAb對TMX結構類似物的交叉反應見表2.

24 TMX-pAb對TMX結構類似物的交叉反應

由表2可知,TMX-pAb對啶蟲脒和烯啶蟲胺無識別反應,交叉反應率均小于1%；對吡蟲啉、噻蟲啉和噻蟲胺有弱識別作用,但交叉反應率均低于5%；對實驗合成的半抗原有高度交叉反應性,交叉反應率達到了102.41%.

3 結論

藥物半抗原的分子結構特點決定了通過其制備的抗體的特異性與親和性,通過不同結構的半抗原制備的免疫抗原免疫動物所產生的抗體的親合性與特異性差別往往很大,因此,藥物半抗原的設計與合成是建立小分子免疫化學分析的關鍵.考慮到小分子的抗原物質不能被大分子的載體蛋白所“淹沒”,同時考慮到半抗原分子可能會因折疊、彎曲等影響到抗體的識別特性,本研究通過對噻蟲嗪化學結構的簡單修飾,在遠離噻蟲嗪關鍵藥效基團的分子遠端引入了5個碳鏈長度的間隔臂,合成了噻蟲嗪半抗原,并以此半抗原與載體蛋白相偶連制備的免疫抗原免疫實驗動物制得了高交價的多克隆抗體,交叉實驗證明了所制備多克隆抗體對同屬新氯化煙堿殺蟲劑的啶蟲脒和烯啶蟲胺沒有交叉反應現象,吡蟲啉、噻蟲啉和噻蟲胺有弱的交叉反應,這些差別與噻蟲嗪本身的化學結構特點有關,其規律是與噻蟲嗪結構類同點越多交叉反應率越高,可見噻蟲嗪分子中的噻唑環和二嗪環在抗原抗體免疫反應中起著重要作用.

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（責任編輯：鄧天福）

Study on immunological determ ination of im idacloprid residues

LiGuangling,Li Xin'an,Li Jinli,Xiao Nana,Zhao Yajuan,Chen Xiling
（Henan Instituteof Science and Technology,Xinxiang 453003,China）

Chemical modification method was employed to synthesize the thiamethoxam（TMX）hapten,which was then coupled with BSA and OVA to prepare immunogen（TMX-BSA）and coating antigen（TMX-OVA）through EDC method,respectively.And satisfied molecule coupling ratios between the TMX hapten and carrier proteins were eventually obtained.The immunological characteristics of TMX has been defined by indirect ELISA and blocking ELISA.This is an important and beneficial attempt to establish immunology rapid determination technology of TMX residues and develop corresponding determination products.

thiamethoxam,polyclonal antibody,residue,ELISA

S482.3

A

1008-7516（2011）05-0020-06

10.3969/j.issn.1008-7516.2011.05.005

2011-08-13

“十一五”國家科技支撐計劃重大專項（2006BAK02A21/1）

李廣領（1976-）,男,河南平頂山人,碩士,實驗師.主要從事農藥殘留分析研究.

陳錫嶺（1962-）,男,河南安陽人,教授,碩士生導師.主要從事農藥環境毒理學研究.