2－溴乙烷磺酸鈉對ABR反應器運行效果和微生物菌群結構的影響

鄧遵，彭劍峰，宋永會* ，袁林江

1.西安建筑科技大學環境與市政工程學院，陜西 西安 710055

2.中國環境科學研究院城市水環境科技創新基地，北京 100012

目前厭氧反應器酸化問題日益嚴重，國內外有很多關于厭氧折流板反應器(Anaerobic Baffled Reactor，ABR)酸化特征及相應的恢復方法的研究報道［1-3］。這些研究主要集中在由高負荷運行引起的pH降低以及反應器酸化，恢復方法的研究局限于降低負荷、提高堿度等物理化學恢復方法。對于其他問題引起的酸化(如抑制劑對微生物的抑制作用引起的酸化等)及其對ABR反應器的運行效果和微生物群落影響的研究較為缺乏，因而難以為酸化恢復方法的拓展提供有效支撐。

表面活性劑既是民用洗滌劑的重要原料，又是眾多工業部門所必需的助劑，所以有“工業味精”的美稱，并開始向獨立的精細化工產品的方向發展。隨著世界人口數量的增加，對日化產品的需求也同步增長［4］。2- 溴乙烷磺酸鈉(BrCH2CH2SO3Na，BES)是合成新型表面活性劑不可缺少的原料之一［5-8］，如以BES、乙二胺、月桂酸等為主要原料合成的陰離子型雙子表面活性劑乙撐-雙(N-乙磺酸-十二酰胺)鈉鹽，以及以BES為親水基物料和烷基咪唑啉合成的磺基咪唑啉甜菜堿表面活性劑等。

同時，2-溴乙烷磺酸鈉是產甲烷菌特有的輔酶M(2-巰基乙烷磺酸)的結構類似物，可選擇性地抑制幾乎所有產甲烷菌的產甲烷活性［9］，當產甲烷菌受到抑制時，產酸菌和產甲烷菌之間的代謝平衡將會遭到破壞，乙酸、甲酸、甲醇等物質不能通過產甲烷菌的作用而降解，造成乙酸等揮發性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)的積累，使厭氧消化過程滯留在產酸階段，從而導致反應器的酸化。筆者分析了由BES引起的厭氧酸化過程中反應器內CODCr去除率、pH以及VFA的變化，并著重研究了BES對ABR各隔室污泥中微生物群落結構及其演替特征的影響，以期為采用新型生物技術解決酸化問題提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 裝置與方法

試驗裝置為三隔室ABR厭氧反應器(圖1)，反應器總體積為9 L，設計水力停留時間為24 h，溫度維持在(35±1)℃。試驗采用模擬廢水(CODCr∶N∶P=350∶5∶1)，其中進水 CODCr為 2000 mg/L 左右。接種污泥取自閑置反應器中的厭氧顆粒污泥，接種量為3 L。BES投加在進水箱中，投加量從0 mmol/L逐漸提高到0.27 mmol/L。

圖1 ABR處理工藝流程Fig.1 Schematic diagram of the anaerobic baffled reactor

1.2 分析方法

1.2.1 常規指標分析方法

CODCr采用重鉻酸鉀法測定;pH采用PH S-25型數顯pH計測定;VFA采用氣相色譜法測定。

1.2.2 熒光原位雜交技術(FISH)

污泥樣品用4%多聚甲醛于4℃恒溫固定過夜，再利用PBS和乙醇洗滌固定液于-20℃保存備用。利用超聲打散樣品，經預處理后，于46℃雜交2 h，DAPI染色，熒光抗淬滅封片劑封片，在Olympus BX51熒光顯微鏡下觀察、拍照，每種微生物拍5～8組照片，通過Image-Pro-Plus軟件對照片進行計數分析，最后取平均值，標準偏差為±0.1，FISH試驗中采用的探針［10-13］如表1所示。

1.2.3 聚合酶鏈式反應－變性梯度凝膠電泳技術(PCR－DGGE)

采用Qiagen公司生產的離心式DNA快速提取試劑盒(Qiagen，美國)提取細菌的總DNA，提取到的總DNA采用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。再將提取到的DNA進行PCR擴增，采用套式PCR技術，所用引物如表2所示。首先采用細菌通用的27F和1378R引物對總細菌16S rDNA進行擴增。第二輪PCR以第一輪PCR的產物作為模板，使用357F-GC和518R引物對總細菌16S rDNA V3區進行擴增。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

表1 試驗所選用的探針類型Table 1 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes used in this study

表2 PCR擴增中使用的引物Table 2 List of the primers used in PCR amplification

使用D-Code系統(Biorad，美國)對PCR擴增后的產物進行DGGE分離。DGGE電泳結果采用Genfinder(Invitrogen，美國)進行染色，并利用凝膠成像系統(Biorad GelDoc XR，美國)對染色后的DGGE結果進行觀察、拍照。將含目的DNA條帶的凝膠割下，放入200μL離心管中搗碎，再加入20μL超純水(ddH2O)，在4℃過夜溶解。取上清液進行PCR，引物采用357F和518R，將PCR產物送至上海生工測序中心進行 DNA片段序列測定，測序結果與NCBI基因文庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)的已知序列進行對比。

1.2.4 圖譜解析方法

各樣品間的相似度指數可用Dice指數(CS)表示［14］，其計算公式:

式中，j為2個樣品間共有條帶數;a、b分別為2個樣品各自條帶數。

采用Shannonce-Wiener多樣性指數(H')表征微生物種群多樣性［15］，其計算公式:

式中，pi=ni/N;ni為第i個條帶的強度;N為所有條帶強度之和。

采用種群豐富度指數(R)表征樣品的微生物豐富度［16］，其計算公式:

采用優勢度指數(D)表征樣品中優勢種群的優勢程度，其計算公式:

2 結果與分析

2.1 對CODCr、pH及VFA的影響

圖2和圖3為BES對ABR反應器中CODCr及pH的影響。由圖2和圖3可知，隨著BES濃度的增加，反應器內 CODCr去除率及 pH急劇下降;當BES濃度為0.13 mmol/L時，CODCr去除率降到20%以下，出水pH降到6.0以下;當BES濃度增至0.2和0.27 mmol/L時，其去除率降到10%以下，出水pH降到5.5以下，ABR反應器出現了酸化。

VFA是污染物降解的中間產物，也是評估反應器正常運行與否的重要指標。BES對ABR反應器中VFA濃度的影響如圖4所示。正常運行時，VFA濃度隨著隔室的增加而減少，出水中只含有少量的乙酸和丙酸，濃度不超過40μmol/L。而廢水中投加BES后，反應器內VFA濃度不僅不隨著隔室的增加而減少，反而隨著隔室的增加而增加，出水VFA濃度達到15.3 mmol/L左右;且VFA的種類有所增加，除了乙酸、丙酸之外，還有丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、己酸、異己酸和庚酸，其中丁酸、戊酸、己酸等占36%左右。

綜合考慮CODCr去除率、pH及VFA濃度的變化可知，投加BES后，CODCr去除率急劇下降到10%以下，出水pH降到5.5以下，出水VFA濃度達到15.3 mmol/L左右，ABR反應器形成了酸化環境。這說明BES能抑制產甲烷菌產甲烷活性［9］，導致VFA等中間產物無法轉化為CH4等最終產物，造成VFA嚴重積累，從而導致CODCr去除率下降，反應器內的pH降低，VFA濃度增大及種類增多，最終導致ABR反應器酸化。

2.2 對微生物豐富度的影響

取投加BES運行穩定后污泥樣品，利用FISH技術來表征BES對ABR反應器內真細菌、古細菌及典型微生物相對豐度的影響，結果如圖5所示。由圖5可知，投加BES之后，真細菌的相對豐度有所增加，平均增加了40%，真細菌里的典型微生物種群產氫產乙酸菌和耗氫產乙酸菌的相對豐度也有所增加，其中產氫產乙酸菌增加了9%，耗氫產乙酸菌增加了7%。而古細菌的相對豐度下降了30%，厭氧消化過程中最關鍵的產甲烷菌的相對豐度平均下降了25%左右。

圖5 BES對ABR反應器內各種微生物相對豐度的影響Fig.5 Effect of2-bromoethane sulfonate on relative abundance of microorganisms in ABR reactor

由圖5可知，BES對產甲烷菌具有強烈的抑制作用，由于BES抑制了產甲烷菌的活性，使產甲烷菌不能消耗VFA，進而造成了VFA的積累。VFA的積累會進一步抑制產甲烷菌的活性，造成惡性循環，因此產甲烷菌的相對豐度大大降低。產甲烷菌是ABR反應器中最主要的古細菌，其豐富度的降低造成古細菌的相對豐度大幅減少。

VFA的積累增加了產氫產乙酸菌所能利用的營養底物，促進了產氫產乙酸菌的生長繁殖，同時釋放出更多的氫氣，氫氣的增加又會促進耗氫產乙酸菌的作用，刺激耗氫產乙酸菌的生長，因此產氫產乙酸菌和耗氫產乙酸的相對豐度都有很大程度的提高。

2.3 對真細菌種群結構的影響

2.3.1 DGGE指紋圖譜、相似性與多樣性分析

對ABR反應器正常運行及投加BES運行穩定后的各隔室污泥樣品進行DNA提取，PCR擴增及DGGE分析，可得到真細菌的DGGE指紋圖譜，如圖6所示。

圖6 投加BES前后ABR反應器內各隔室厭氧污泥的DGGE指紋圖譜Fig.6 DGGE fingerprints patterns of anaerobic sludge in the compartments of ABR reactor

由圖6可見，六個樣品的DGGE條帶數量有明顯的差異，投加BES之后，DGGE條帶數有所減少;并且不同污泥樣品中的優勢菌種結構發生了很大的改變。污泥樣品的種群相似度(表3)均在75%以下，第一隔室的相似度為67.8%，第二隔室的相似度為74.2%，第三隔室的相似度僅為59.4%。在樣品a中，Band1和Band2是正常運行時第一隔室的優勢菌帶，而在樣品d中，除了Band1和Band2繼續存在以外，增加了五條很亮的條帶。對比b和e兩個樣品，樣品e中有五條很亮的條帶，而在樣品b中有三種菌帶雖然存在，但是亮度有所減弱，并且優勢菌帶不明顯。樣品c中的優勢菌帶為 Band8和Band10，在樣品f中，Band8依然存在，但是亮度有所減弱，同時增加了四種優勢菌帶。

表3 污泥DGGE指紋圖譜的相似度矩陣Table 3 Dice index comparing the similarity of DGGE fingerprints %

微生物種群多樣性指數(H')、豐富度指數(R)和優勢度指數(D)分別是從不同角度反映微生物種群類型、種群結構的差異以及種群演替的變化。各指數的計算結果見表4。由表4可知，投加BES之后，ABR反應器內各隔室的污泥樣品的DGGE指紋圖譜中條帶數即微生物種數均有所減少，種群的多樣性指數和豐富度也呈現出相似的變化特征。而投加BES之后，ABR反應器內的優勢微生物的優勢度明顯增大。

表4 投加BES前后ABR反應器內各隔室污泥中微生物種群多樣性指數Table 4 Microbial community diversity index of anaerobic sludge in the compartments of ABR reactor

通過圖6，表3和表4的比較可知，投加BES后，微生物種群結構發生了顯著變化。首先，有一些對環境敏感的細菌死亡并消失，使得反應器內的真細菌種類有所減少，導致微生物種群多樣性和豐富度相應減少，說明BES對ABR反應器內某些種類的細菌有很強的抑制作用。其次，ABR反應器內的優勢微生物種類增多，并且優勢度明顯。這可能是因為微生物種群的自主馴化作用，投加BES后，經過一個月的馴化培養，誘發出適應BES的微生物，同時淘汰劣勢微生物，因此優勢微生物的數量增多，優勢度提高。

2.3.2 部分優勢菌種的鑒定

將目標微生物進行DNA片段序列測定，其測序結果與NCBI數據庫中的已知菌種的序列進行比對，結果如表5所示。由表5可知，投加 BES后，ABR反應器各隔室的優勢微生物均發生了很大改變。以第一隔室為例，ABR正常運行時的優勢微生物與Uncultured bacterium clone cs78相似度為99%，屬于Firmicutes(厚壁菌)，與乳酸鹽和硫酸鹽的去除有關［17］。而投加BES后，優勢微生物變為與 Uncultured bacterium clone 23-1、Uncultured rumen bacterium clone RDX_194-Control_0_hr、Uncultured bacterium SHA-116及Uncultured bacterium clone:OS-100相似。其中 Uncultured bacterium clone 23-1屬于 Bacteroides(擬桿菌)，與乙醇發酵有關［18］;Uncultured rumen bacterium clone RDX_194 屬于 Bacterium，與 1，3，5-trinitro-1，3，5-triazacyclohexane的轉化有關;Uncultured bacterium SHA-116與氯的去除有關，屬于Spirochaetes(螺旋體菌)［19］;而 Uncultured bacterium clone:OS-100 是δ-proteobacteria(δ-變形菌)，與乙酸鹽或甲醇的同化有關［20］。

表5 部分優勢細菌的克隆測序結果Table 5 Phylogenetics of dominant bacteria

通過優勢細菌的測序結果可知，投加BES后，ABR反應器各隔室內的優勢微生物種群發生了很大改變，第一隔室由厚壁菌門變為擬桿菌門、螺旋菌門及δ-變形菌門;第二隔室的優勢微生物由擬桿菌門、厚壁菌門變為地桿菌科微生物、δ-變形菌門及厚壁菌門;第三隔室由桿菌屬、厚壁菌門變為厚壁菌門及螺旋菌門。

3 結論

(1)隨著進水中BES投加量從0 mmol/L增加到0.27 mmol/L，ABR反應器的 CODCr去除率從95%降到10%，且一直維持在10%以下，出水pH從6.0～7.0降到5.5以下。說明BES的投加對厭氧消化過程有很大的影響，容易導致反應器酸化。

(2)BES的投加，造成反應器內VFA明顯積累，VFA濃度隨著隔室的增加而增加，出水VFA濃度達到15.3 mmol/L左右;同時出水VFA組成由BES投加前的以乙酸、丙酸為主，變為乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、己酸、異己酸和庚酸，其中丁酸、戊酸、己酸等占總VFA的36%。

(3)BES會抑制產甲烷菌的活性，從而使產甲烷菌的相對豐度平均降低25%左右。同時，BES使產氫產乙酸菌及耗氫產乙酸菌的相對豐度分別增加了9%和7%。

(4)投加BES后，ABR反應器各隔室的微生物種群結構發生了顯著變化，其最低相似度僅為59.4%。BES的投加，使ABR中的微生物種類、種群多樣性及豐富度均有所降低，微生物種類由二十幾種降到十幾種，種群多樣性指數由3.27降到2.75;優勢微生物種群由厚壁菌門、桿菌屬變為擬桿菌門、螺旋菌門及δ-變形菌門。

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