彈性填料對ABR的處理效果及細菌群落結構的影響

張 超，張國珍，馬 凱

(蘭州交通大學 環境與市政工程學院，蘭州 730070)

西北干旱地區村鎮生活污水水質單一，經適當處理后可就近用于村鎮周邊農作物灌溉，從而有效解決當地水資源短缺和水環境污染問題[1-2].

ABR處理污水費用低、污泥產率低，但其啟動時間長、出水COD較高，出水難以長期穩定地滿足農作物灌溉水質標準[3-5].研究表明，在ABR中添加彈性填料可以縮短其啟動時間[6]，提高其對COD去除效果的穩定性[7]，強化其抗低溫和抗負荷能力[8-9]，且對氮磷去除率影響很小[10].但這些研究都是關于添加彈性填料對ABR去除COD的整體強化效果，而關于添加彈性填料對ABR各隔室中COD的去除效果及細菌群落結構的影響研究卻未見報道.

目前通過高通量測序技術研究污染物去除與微生物群落結構組成及豐度變化的關系的報道較多[11-12]，且該技術在ABR中的研究也有所涉及.陳重軍等[13]研究了厭氧氨氧化型ABR中的細菌群落結構，發現ABR中變形菌門豐度最高，且沿程增加，而浮霉菌門沿程降低.Shen等[14]研究了ABR-MBBR系統中的微生物群落結構，發現副球菌、硫桿菌和巴氏桿菌是系統中的優勢菌.ABR中污染物的去除主要通過細菌的作用實現，故本文為研究添加彈性填料對ABR各隔室中COD的去除效果及細菌群落結構的影響，擬采用兩組ABR進行對比，通過高通量測序技術研究添加彈性填料對ABR中細菌群落結構的影響，為有效解決西北干旱地區水資源短缺和水環境污染問題提供技術參考.

1 材料與方法

1.1 實驗裝置

兩組ABR結構和尺寸完全一致，由四個隔室組成，長751 mm，寬180 mm，高500 mm，體積49.6 L.其中一組ABR的上部添加彈性填料，系統構造圖如圖1所示.

1.2 實驗用水和方法

實驗用水為校園家屬區生活污水，COD濃度100.84～310.03 mg/L，氨氮濃度22.56～39.95 mg/L，總氮濃度24.91～45.37 mg/L，總磷濃度2.45～4.75 mg/L.兩組ABR都在常溫下運行，水力停留時間都為1 d，待兩組ABR運行穩定后(已運行近10個月，對COD的去除效果已穩定1個月)，分別同時從兩組ABR各隔室中取水樣測定(每隔6 d取1次，共取5次).

1.3 分析項目與測定方法

COD：重鉻酸鉀法.

1.4 高通量測序分析方法

1.4.1 樣本采集

待兩組ABR運行穩定后，分別同時從兩組ABR各隔室中取少量污泥，并從有彈性填料ABR中取彈性填料上少量的泥膜于10 mL離心管中.有彈性填料ABR第1～4隔室中的樣本(污泥和泥膜的混合物)分別命名為A(A1、A2和A3)、B(B1、B2和B3)、C(C1、C2和C3)、D(D1、D2和D3)，無彈性填料ABR第1～4隔室中的樣本(污泥)分別命名為E(E1、E2和E3)、F(F1、F2和F3)、G(G1、G2和G3)和H(H1、H2和H3)，所有樣本先經-4 ℃冰箱冷凍，再包裹保溫材料寄往檢測公司.

1.4.2 DNA提取與檢測

用Water DNA Isolation Kit試劑盒進行提取.

1.4.3 PCR擴增

用通用引物對細菌16S rRNA基因進行擴增，引物名稱和序列為：上游(338F和ACTCCTACGGGAGGCAGCA)，下游(806R和GGACTACHVGGGTWTCTAAT).

1.4.4 PCR產物定量、混樣

用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit進行定量，按樣本所需的數據量進行混樣.

1.4.5 文庫構建

用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit進行建庫.

1.4.6 文庫質檢與定量

取1 uL文庫，用Agilent High Sensitivity DNA Kit做2100質檢，用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit進行定量.

1.4.7 測序

測序區域為標準細菌16S V3-V4區，目的片段長度為480 bp，測序策略為NovaSeq-PE250.

1.5 數據分析、處理和統計方法

每個水樣的COD測兩組平行樣，用Origin軟件作圖.每個泥樣測三組平行樣，OUT數目和各分類水平上的細菌群落結構豐度先取平均值，再用QIIME2軟件作圖，Alpha多樣性指數直接作圖.

通過細菌群落花瓣圖分析，了解不同樣本之間共有與特有物種數目的差異.通過Alpha多樣性指數分析，了解某一樣本中細菌群落的豐富度、多樣性和均勻度.通過門(屬)分類水平上的細菌群落結構分析，了解不同樣本之間細菌群落結構在種類和相對豐度上的差異.

2 結果與討論

2.1 COD的去除效果

兩組ABR各隔室中平均COD去除率如圖2所示.由圖2可以看出，兩組ABR第1隔室中的平均COD去除率最高，這主要是因為流入第1隔室中的污水COD最高，故第1隔室中的厭氧微生物可以優先利用進水中易于降解的COD.

與無彈性填料ABR相比，有彈性填料ABR第1隔室中的平均COD去除率較高，這主要是因為彈性填料可以較好地截留污水中的SS，且彈性填料上附著生長了一定量的微生物，使有彈性填料ABR第1隔室中的生物量有所增加.但有彈性填料ABR第2、3隔室中的平均COD去除率卻低于無彈性填料ABR，這主要是因為進入無彈性填料ABR第2、3隔室中污水的COD較高.兩組ABR第4隔室中的平均COD去除率相差不大，這主要是因為進入兩組ABR第4隔室中污水的COD都很低.

圖2 兩組ABR各隔室中平均COD去除率Fig.2 The average removal rate of COD in each compartment of ABR in two groups

2.2 細菌群落花瓣圖分析

兩組ABR各隔室中細菌群落花瓣圖如圖3所示.由圖3可以看出，兩組ABR都是第1隔室中特有的OTU數目最多，且無彈性填料ABR各隔室中特有的OTU數目沿著水流方向逐漸減少，而有彈性填料ABR各隔室中特有的OTU數目雖然沿著水流方向上下波動，但總的趨勢是減少的，表明兩組ABR都是第1隔室中特有的細菌群落最多，且無彈性填料ABR各隔室中特有的細菌群落沿著水流方向逐漸減少，而有彈性填料ABR各隔室中特有的細菌群落雖然沿著水流方向上下波動，但總的趨勢是減少的.這說明兩組ABR前面隔室中較高的有機物濃度有利于特有細菌群落的生長和繁殖，而兩組ABR后面隔室中較低的有機物濃度不利于特有細菌群落的生長和繁殖.

與無彈性填料ABR相比，有彈性填料ABR前三個隔室中特有的OTU數目較少，而最后一個隔室中特有的OTU數目較多，這說明彈性填料減少了ABR前三個隔室中特有的細菌群落，但增加了ABR最后一個隔室中特有的細菌群落.這主要是因為添加彈性填料使有彈性填料ABR各隔室中的生物量有所增加，而兩組ABR進水中的有機物濃度相同，與無彈性填料ABR相比，有彈性填料ABR前三個隔室中特有的細菌群落所能獲得的有機物較少，而取樣期間有彈性填料ABR最后一個隔室中的有機物濃度可能高于無彈性填料ABR.

圖3 細菌群落花瓣圖Fig.3 Petal diagram of bacterial community

2.3 Alpha多樣性指數

Chao1和Observed species指數用于衡量群落的豐富度，Simpson和Shannon指數用于衡量群落的多樣性，Pielou’s evenness指數用于衡量群落的均勻度[15].兩組ABR各隔室中細菌群落豐富度和均勻度變化如表1所列.由表1可以看出，兩組ABR各隔室中Chao1指數和Observed species指數、Simpson指數和Shannon指數總的趨勢是沿著水流方向逐漸減小，這說明兩組ABR各隔室中細菌群落的豐富度和多樣性總的趨勢是沿著水流方向逐漸降低，這主要是因為兩組ABR各隔室中有機物濃度總的趨勢是沿著水流方向逐漸降低.與無彈性填料ABR相比，有彈性填料ABR前三個隔室中Chao1指數和Observed species指數、Simpson指數和Shannon指數有所降低，而最后一個隔室中Chao1指數和Observed species指數、Simpson指數和Shannon指數有所提高，這說明彈性填料降低了ABR前三個隔室中細菌群落的豐富度和多樣性，但提高了ABR最后一個隔室中細菌群落的豐富度和多樣性.這主要是因為添加彈性填料使有彈性填料ABR各隔室中的生物量有所增加，而兩組ABR進水中的有機物濃度相同，與無彈性填料ABR相比，有彈性填料ABR前三個隔室中細菌群落所能獲得的有機物較少，而取樣期間有彈性填料ABR最后一個隔室中的有機物濃度可能高于無彈性填料ABR.兩組ABR各隔室中Pielou’s evenness指數總的趨勢是沿著水流方向逐漸減小，這說明兩組ABR各隔室中細菌群落的均勻度總的趨勢是沿著水流方向逐漸降低.與無彈性填料ABR相比，有彈性填料ABR第1、3隔室中Pielou’s evenness指數有所降低，而第2、4隔室中Pielou’s evenness指數有所提高，這說明彈性填料降低了ABR第1、3隔室中細菌群落的均勻度，但提高了ABR第2、4隔室中細菌群落的均勻度.

表1 細菌群落豐富度、多樣性和均勻度變化

2.4 門分類水平上的細菌群落結構

門分類水平上的細菌群落結構圖體現了樣本在門分類水平上細菌群落的種類和相對豐度.兩組ABR各隔室中門分類水平上的細菌群落結構如表2所列.由表2可以看出，兩組ABR各隔室中門分類水平上的優勢細菌群落(相對豐度達到1%)包括：Actinobacteria(放線菌門)、Firmicutes(厚壁菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)、Chloroflexi(綠彎菌門)、Proteobacteria(變形菌門)和Synergistetes(互養菌門)，這些優勢細菌群落的平均相對豐度之和超過80%.有研究表明，變形菌門的存在有利于硝化反硝化作用、生物除磷和污染物的降解[16]，厚壁菌門的存在有利于硝化作用和有機物的降解[17]，擬桿菌門的存在有利于反硝化作用、蛋白質和有機物的降解[18]，放線菌門的存在有利于氨基酸等有機物的降解[19]，綠彎菌門的存在有利于溶解性有機物、EPS和微生物殘體的降解[20]，互養菌門的存在有利于產甲烷階段的進行[21].

表2 門分類水平上的細菌群落結構

表2中，Synergistetes在兩組ABR各隔室中的平均相對豐度最高，且兩組ABR各隔室中Synergistetes的相對豐度沿著水流方向逐漸提高，這說明Synergistetes是兩組ABR各隔室中最具優勢的細菌群落，且沿著水流方向逐漸增殖.雖然兩組ABR各隔室中Actinobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、Chloroflexi和Proteobacteria的相對豐度沿著水流方向有所波動，但從總的趨勢來看，兩組ABR各隔室中Firmicutes、Chloroflexi和Proteobacteria的相對豐度沿著水流方向降低，Actinobacteria的相對豐度沿著水流方向提高；而Chloroflexi在無彈性填料ABR各隔室中的相對豐度沿著水流方向降低，在有彈性填料ABR各隔室中的相對豐度沿著水流方向提高，這說明兩組ABR各隔室中Actinobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、Chloroflexi和Proteobacteria沿著水流方向經歷了增殖和衰減的交替變化，最終，Firmicutes、Chloroflexi和Proteobacteria出現了衰減，Actinobacteria出現了增殖，而Chloroflexi在無彈性填料ABR中出現了衰減，在有彈性填料ABR中出現了增殖.

與無彈性填料ABR相比，有彈性填料ABR第1隔室中Synergistetes的相對豐度提高較多，Chloroflexi的相對豐度降低較多；第2隔室中Proteobacteria的相對豐度提高較多，Bacteroidetes的相對豐度降低較多；第3隔室中Chloroflexi和Synergistetes的相對豐度提高較多，Firmicutes和Bacteroidetes的相對豐度降低較多；第4隔室中Proteobacteria和Firmicutes的相對豐度提高較多，Synergistetes的相對豐度降低較多.這說明添加彈性填料使ABR第1隔室中Synergistetes增殖較多，Chloroflexi衰減較多；第2隔室中Proteobacteria增殖較多，Bacteroidetes衰減較多；第3隔室中Chloroflexi和Synergistetes增殖較多，Firmicutes和Bacteroidetes衰減較多；第4隔室中Proteobacteria和Firmicutes增殖較多，Synergistetes衰減較多.

2.5 屬分類水平上的細菌群落結構

屬分類水平上的細菌群落結構圖體現了樣本在屬分類水平上細菌群落的種類和相對豐度.兩組ABR各隔室中屬分類水平上的細菌群落結構如表3所列.由表3可以看出，兩組ABR各隔室中屬分類水平上的優勢細菌群落包括：Desulfobulbus(脫硫葉菌屬)、Aminiphilus、Syntrophorhabdus(互營桿菌屬)、Smithella(史密斯氏菌屬)、ChristensenellaceaeR-7group、JGI-0000079-D21、Lactivibrio和Desulfomicrobium(脫硫微菌屬)，這些優勢細菌群落的平均相對豐度之和接近15%.

表3中，Desulfomicrobium在兩組ABR各隔室中的平均相對豐度最高，且兩組ABR各隔室中Desulfomicrobium的相對豐度沿著水流方向逐漸降低，這說明Desulfomicrobium是兩組ABR各隔室中最具優勢的細菌群落，且沿著水流方向逐漸衰減.雖然兩組ABR各隔室中Desulfobulbus、Aminiphilus、Syntrophorhabdus、Smithella、ChristensenellaceaeR-7group、JGI-0000079-D21和Lactivibrio的相對豐度沿著水流方向有所波動，但從總的趨勢來看，兩組ABR各隔室中Desulfobulbus和Syntrophorhabdus的相對豐度沿著水流方向降低，Aminiphilus的相對豐度沿著水流方向提高；在無彈性填料ABR各隔室中，JGI-0000079-D21的相對豐度沿著水流方向提高，Smithella、ChristensenellaceaeR-7group和Lactivibrio的相對豐度沿著水流方向降低，而在有彈性填料ABR各隔室中，Smithella、ChristensenellaceaeR-7group、JGI-0000079-D21和Lactivibrio的相對豐度沿著水流方向變化很小，這說明兩組ABR各隔室中Desulfobulbus、Aminiphilus、Syntrophorhabdus、Smithella、ChristensenellaceaeR-7group、JGI-0000079-D21和Lactivibrio沿著水流方向經歷了增殖和衰減的交替變化，最終，Desulfobulbus和Syntrophorhabdus出現了衰減，Aminiphilus出現了增殖；而在無彈性填料ABR各隔室中，JGI-0000079-D21出現了增殖，Smithella、ChristensenellaceaeR-7group和Lactivibrio出現了衰減，在有彈性填料ABR各隔室中，Smithella、ChristensenellaceaeR-7group、JGI-0000079-D21和Lactivibrio增殖和衰減不明顯.

表3 屬分類水平上的細菌群落結構

與無彈性填料ABR相比，有彈性填料ABR第1隔室中Smithella和JGI-0000079-D21的相對豐度提高較多，Desulfomicrobium的相對豐度降低較多；第2隔室中Desulfobulbus和Desulfomicrobium的相對豐度提高較多；第3隔室中Smithella和Desulfomicrobium的相對豐度降低較多；第4隔室中Smithella、ChristensenellaceaeR-7group和Desulfomicrobium的相對豐度提高較多，Aminiphilus、JGI-0000079-D21和Lactivibrio的相對豐度降低較多.這說明添加彈性填料使ABR第1隔室中Smithella和JGI-0000079-D21增殖較多，Desulfomicrobium衰減較多；第2隔室中Desulfobulbus和Desulfomicrobium增殖較多；第3隔室中Smithella和Desulfomicrobium衰減較多；第4隔室中Smithella、ChristensenellaceaeR-7group和Desulfomicrobium增殖較多，Aminiphilus、JGI-0000079-D21和Lactivibrio衰減較多.

3 結論

1) 彈性填料提高了ABR第1隔室中的平均COD去除率，降低了第2、3隔室中的平均COD去除率，對第4隔室中的平均COD去除率影響不大.

2) 彈性填料減少了ABR第1～3隔室中特有的細菌群落，但增加了ABR第4隔室中特有的細菌群落.

3) 彈性填料降低了ABR第1～3隔室中細菌群落的豐富度和多樣性，第1、3隔室中細菌群落的均勻度；但提高了ABR第4隔室中細菌群落的豐富度和多樣性，第2、4隔室中細菌群落的均勻度.

4) 在門分類水平上，添加彈性填料使ABR第1隔室中Synergistetes增殖較多，Chloroflexi衰減較多；第2隔室中Proteobacteria增殖較多，Bacteroidetes衰減較多；第3隔室中Chloroflexi和Synergistetes增殖較多，Firmicutes和Bacteroidetes衰減較多；第4隔室中Proteobacteria和Firmicutes增殖較多，Synergistetes衰減較多.

5) 在屬分類水平上，添加彈性填料使ABR第1隔室中Smithella和JGI-0000079-D21增殖較多，Desulfomicrobium衰減較多；第2隔室中Desulfobulbus和Desulfomicrobium增殖較多；第3隔室中Smithella和Desulfomicrobium衰減較多；第4隔室中Smithella、ChristensenellaceaeR-7group和Desulfomicrobium增殖較多，Aminiphilus、JGI-0000079-D21和Lactivibrio衰減較多.