SPE-HPLC測定小兒氨酚黃那敏顆粒中4種合成色素

張西如，趙江麗，姜建國，韓彬

(河北省食品藥品檢驗院，石家莊 050011)

SPE-HPLC測定小兒氨酚黃那敏顆粒中4種合成色素

張西如，趙江麗，姜建國，韓彬

(河北省食品藥品檢驗院，石家莊 050011)

目的 建立小兒氨酚黃那敏顆粒劑中合成色素的SPE-HPLC測定方法。方法 使用SPE固相萃取柱對合成著色劑進行凈化、富集；采用HPLC測定含量。色譜柱為Inertsil ODS-3 C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以甲醇-0.02 mol·L-1乙酸銨溶液為流動相，梯度洗脫；檢測波長為各自的最大吸收波長(檸檬黃428 nm，日落黃521 nm，胭脂紅509 nm，莧菜紅483 nm)；柱溫30 ℃；進樣量10 μL；流速1.0 mL·min-1。結果 檸檬黃、日落黃、莧菜紅和胭脂紅在0.05～4 μg·mL-1內呈良好線性關系(r≥0.999 5)，平均回收率分別為98.0%，97.9%，98.6%和99.5%，RSD均＜0.9%。結論 該法操作簡便、準確、重復性好，可用于同時測定小兒氨酚黃那敏顆粒中的4中合成色素。

合成色素；高效液相色譜法；固相萃取

合成色素是廣泛使用的藥用輔料，硬膠囊殼、糖衣片和薄膜衣片、顆粒劑等都會適量添加以增加外觀的美觀性，尤其是兒童用顆粒劑，需用水溶解后服用。合成色素的鮮艷色澤還可以增加兒童服藥的主動性。但合成色素是以苯、甲苯、萘等化工產品為原料化學合成的[1]，許多合成色素在生物體內可以轉化成有害的衍生物[2-3]，如致癌性物質α-氨基萘酚、β-萘胺[4]。因此，世界各國對合成色素的可用品種、適用范圍和使用量均有嚴格的規定[3]。藥品中添加的色素多為水溶性，而水溶性色素耐光、熱等穩定性差，產品易褪色[5]，為保證產品色澤往往會增大色素的添加量，所以有必要監測色素的使用情況，以保證藥品在生產和使用過程中的質量和安全性。本研究建立小兒氨酚黃那敏顆粒劑中4種合成色素的SPE-HPLC含量測定方法，并對市場上小兒氨酚黃那敏顆粒劑中合成色素的使用情況進行了考察。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

日本島津高效液相色譜系統：LC-20AT型輸液泵，SPD-M20A二極管陣列檢測器，SIL20A自動進樣器，CTO-20A柱溫箱，LC-solution工作站；CP225D電子天平(德國Sartorius)；固相萃取柱：Clernet? JXA(1 g∶6 mL)，臨用前依次用2 mL甲醇和6 mL水進行預處理，保持柱體濕潤。

1.2 試劑

對照品：檸檬黃(批號：C17138000，含量：90.0%)、日落黃(批號：C17048000，含量：87.0%)、胭脂紅(批號：C16284000，含量：70.0%)和莧菜紅(批號：C10148500，含量：81.0%)均購自Dr.Ehrenstorfer GmbH。甲醇和醋酸銨為色譜純，其余試劑為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇(A)-0.02 mol·L-1醋酸銨溶液(B)，梯度洗脫(0～5 min，20% A→40% A；5～12 min，40% A→92% A；12～13 min，92% A→20% A)；流速：1.0 mL·min-1；檢測器：二極管陣列檢測器；檢測波長為各自的最大吸收波長(檸檬黃428 nm，日落黃521 nm，胭脂紅509 nm，莧菜紅483 nm)；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

圖1 HPLC色譜圖A-對照品溶液；B-供試品溶液；1-檸檬黃；2-莧菜紅；3-胭脂紅；4-日落黃Fig 1 HPLC chromatograms A-control; B-sample; 1-tartrazine; 2-amaranth; 3-ponceau 4RC; 4-sunset yellow

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取檸檬黃、日落黃、莧菜紅和胭脂紅對照品適量，用水配制成濃度各為20 μg·mL-1的儲備液。分別精密量取儲備液適量，用水配制成濃度均為4 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

精密稱取顆粒劑2 g，加水10.00 mL溶解，所得溶液上樣至預處理過的固相萃取柱中，依次用水(用甲酸調節pH至4)6 mL、甲醇-甲酸(6∶4) 6 mL、水10 mL，以＜2 mL·min-1的流速清洗，棄去全部流出液；用無水乙醇-氨水-水(7∶2∶1)6 mL洗脫，收集洗脫液至10 mL量瓶中，用乙酸中和，用甲醇-水(4∶6)定容至刻度，即得。按“2.1”項下色譜條件進行檢驗，各待測組分與雜質分離度良好。

2.4 標準曲線繪制

分別精密量取“2.2”項下混合對照品溶液用甲醇-水(4∶6)稀釋成濃度為0.05，0.1，0.3，1，2，4 μg·mL-1的系列標準溶液。精密吸取上述對照品溶液各10 μL分別注入液相色譜儀，進行測定。以峰面積(Y)為縱坐標，相應的對照品濃度(X)為橫坐標，繪制標準曲線，4種合成色素的回歸方程分別為：檸檬黃Y=29 431.78X-137.040 7，r=0.999 8；日落黃Y=25 628.94X-130.935 3，r=0.999 6；胭脂紅Y=23 100.24X-219.078 3，r=0.999 7；莧菜紅Y=28 996.13-60.955 14，r=0.999 6。

結果表明，各成分在0.05～4 μg·mL-1濃度內線性關系良好。

2.5 檢出限

取“2.4”項下對照品溶液，用逐級稀釋法測定檢測限，按S/N=3計，檢出濃度均約為0.005 μg·mL-1。

2.6 儀器精密度

取1 μg·mL-1的對照品溶液，連續進樣6次，計算6次進樣峰面積的RSD。4種色素峰面積的RSD均＜0.52%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性

取同一供試品溶液，分別在0，3，6，12，24 h，精密量取10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，結果不同時間色譜峰面積基本一致，RSD＜0.49%，表明供試品溶液在室溫下24 h內穩定。

2.8 重復性

取某一小兒氨酚黃那敏顆粒樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液6份，注入高效液相色譜儀進行測定，按外標法計算含量。結果檸檬黃的平均含量為5.77 μg·kg-1(RSD=0.5%，n=6)，胭脂紅平均含量為2.02 μg·kg-1(RSD=0.7%，n=6)，表明該方法重復性良好。

2.9 回收率

精密稱取色素空白樣品2 g，分別加入一定濃度的對照品溶液進行模擬回收，平行操作3份，按“2.3”項下方法進行處理，精密量取10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，計算回收率，結果見表1。

表1 回收率測定結果(n=3)Tab 1 Results of recovery(n=3)

2.10 樣品測定

樣品為140個企業生產的430批次小兒氨酚黃那敏顆粒劑，其中有5家企業在藥品說明書中注明使用了色素。采用上述方法對目標色素的含量進行測定，結果見表2。4家企業的樣品檢測出檸檬黃，1家企業檢測出檸檬黃和胭脂紅，其他企業樣品均未檢出色素，與企業說明書標注基本一致。但5家樣品色素檢出量差異很大，以檸檬黃為例，含量最小的為5.77 mg·kg-1，最大的為84.42 mg·kg-1，二者相差近15倍。

表2 顆粒劑中色素的含量Tab 2 Contents of coloring matter in Granules

3 討論

3.1 前處理條件的優化

色素大多極性較強，易溶于水，樣品用水溶解后可直接進樣分析，但顆粒劑中蔗糖的含量較大，所得溶液易堵塞色譜柱和液相色譜儀管路。本實驗采用聚酰胺固相萃取柱對合成色素進行凈化、富集，以除去蔗糖等雜質。聚酰胺在酸性條件下對酸性成分的吸附性好，在堿性條件下解吸。將顆粒劑用水溶解后上樣至預處理過的聚酰胺小柱中，然后依次用水(甲酸調節pH至4)和甲醇-甲酸(6∶4)洗去堿性和中性雜質成分，用水沖洗至中性，再用無水乙醇-氨水-水(7∶2∶1)將合成色素洗脫下來，洗脫液用乙酸中和，定容后可直接注入色譜儀測定，操作簡便，回收率高。

3.2 色譜條件選擇

合成色素常用檢測波長為254 nm，但不同成分的響應差異較大，檢測的靈敏度較差[1]。本實驗使用二極管陣列檢測器，分別在檸檬黃、日落黃、胭脂紅和莧菜紅的最大吸收波長處進行檢測，可提高響應值，從而獲得更低的檢測限和定量限，使定量更準確。合成色素極性較大，在色譜體系中以離子化形式存在，添加無機電解質可以提高響應值、改善分離度[6]，本實驗采用合成色素測定常用的甲醇-0.02 mol·L-1醋酸銨為流動相系統，通過調整洗脫梯度，獲得了滿意的分離度和合理的保留時間。

3.3 樣品測定

本次檢查的430批次顆粒劑，涉及生產企業140家，其中有5家生產企業在藥品說明書中注明使用了色素。采用本實驗建立的研究方法進行檢驗，4家企業的樣品檢測出檸檬黃，1家檢測出檸檬黃和胭脂紅，其他企業樣品均未檢出色素，與企業說明書標注基本一致。但5家企業樣品色素檢出量差異很大，檸檬黃檢出量最小的為0.039 mg·kg-1，最大的為84.42 mg·kg-1(以檸檬黃計)，二者相差甚遠。提示藥品中色素的使用亟需規范。

REFERENCES

[1] ZHANG J W, WU G P, LI Y B, et al. HPLC determination of amaranth of pharmaceutical supplementary materials [J]. Chin J Pharm Anal(藥物分析雜志), 2010, 30(8): 1590-1592.

[2] DOWNHAM A, COLLINS P. Colouring our foods in the last and next millennium [J]. Int J Food Sci Technol, 2000, 35(1): 5-22.

[3] GAO Y X, XU Z H. Research progress on the safety of the natural pigments [J]. Food Sci(食品科學), 2005, 26(S1):158-162.

[4] WANG D Y, YANG X L, LI X Q, et al. HPLC determination of 8 synthetic colorants in canned yellow peach [J]. Phys Test Chem Anal- Part B(理化檢驗-化學分冊), 2010, 46(9): 1034-1036.

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[6] ASHEN J, FU X, PAN X, et al. HPLC determination of synthetic colorants in meat food [J]. Phys Test Chem Anal-Part B(理化檢驗-化學分冊), 2011, 47(2): 139-143.

Simultaneous Determination of 4 Synthetic Colors in Child Paracetamol, Artificial Cow-bezoar and Chlorphena Mine Maleate Granules by SPE-HPLC

ZHANG Xiru, ZHAO Jiangli, JIANG Jianguo, HAN Bin
(Hebei Institute for Food and Drug Control, Shijiazhuang 050011, China)

OBJECTIVE To develop a solid-phase extraction (SPE)-high performance liquid chromatographic( HPLC ) method for the simultaneous determination of tartrazine, sunset yellow, ponceau 4RC and amaranth in Child Paracetamol, Artificial Cow-bezoar and Chlorphena Mine Maleate granules. METHODS The granule sample was dissolved in water, and the solution was purified and enriched by a polyamide SPE column. The eluate obtained was analyzed by HPLC method with Inertsil ODS-3 C18column(4.6 mm×250 mm, 5 μm), methanol-0.02 mmol·L-1ammonium acetate solution as mobile phase with gradient elution. For quantitative analysis, the detection was performed at the maximum absorption of the synthetic colors, they were 428 nm(tartrazine), 521 nm (sunset yellow), 509 nm (ponceau 4RC) and 483 nm (amaranth). The column temperature was 30 ℃ and the flow rate was 1.0 mL·min-1. RESULTS The linear ranges of tartrazine, sunset yellow, ponceau 4RC and amaranth were 0.05-4 μg·mL-1(r≥0.999 5). The average recoveries were 98.0%(RSD=0.52%), 97.9%(RSD=0.38%), 98.6% (RSD=0.27%) and 99.5% (RSD=0.43%), respectively. CONCLUSION The method is simple, accurate, and reproducible, can be used for the quality control of 4 synthetic colors in Child Paracetamol, Artificial Cow-bezoar and Chlorphena Mine Maleate granules.

synthetic colors; HPLC; solid-phase extraction(SPE)

R917.101

B

1007-7693(2013)10-1113-04

2013-01-07

張西如，女，主任藥師 Tel: (0311)85212004-8086 E-mail: zxr3487@126.com