染色質相互作用研究進展

潘有福

(新加坡國立癌癥中心轉化研究實驗室，新加坡 169612)

真核生物的染色體(質)在細胞核內，存在著不同的構象狀態。當經歷細胞分裂周期時，染色體呈現周期性的凝縮和去凝縮的過程。在間期的細胞核中，染色體也需要經過盤繞折疊，形成一種復雜的動態的高級結構。染色體一般以核小體作為基本的結構單位。在人的細胞核中，核小體是由147個DNA堿基對，纏繞在盤狀的堿性組蛋白8聚體(H2A,H2B,H3,H4各2個)外圍而形成。核小體之間還有一段連接DNA, 與H1組蛋白結合。每一條染色質線都是由眾多核小體組成。這種念珠狀的結構，經過多重折疊，并依附于染色體骨架上，形成更緊密高級的結構[1-2]。這種復雜的組織結構解決了將大約2 m長的DNA-組蛋白復合物壓縮進直徑約6μm的微小細胞核的組織結構問題，但同時也對如何將以線性方式攜帶的遺傳信息在一定的時間和空間進行恰當表達提出了難題。因此了解染色體在細胞核內的組織結構及拓撲變化規律，以及這種結構變化對基因表達的調節控制，仍然是研究的熱點之一。

近年發展起來的各種研究染色質相互作用的技術，尤其是染色體構象捕獲技術(Chromosome conformation capture，3C)，為我們研究染色體在細胞核中的三維構象提供了有力的技術手段，利用3C及其衍生技術，我們可以獲得染色質上不同部位，以及染色質纖維之間在特定細胞狀態下的相互作用信息。通過分析這些信息，我們可以了解間期細胞核中的染色體分布狀態和特點，以及增強子和啟動子相互作用以調控基因表達的規律。本文介紹用于研究染色質相互作用的技術，包括顯微觀察和3C及其衍生技術，回顧近年來利用相關技術取得的主要研究進展，并對該技術的應用前景作一討論。

1 顯微鏡觀察

染色體構象的研究技術主要包括傳統的顯微鏡觀察和近些年興起的3C等技術(見表1)。顯微鏡觀察主要是指熒光原位雜交(fuorescence in situ hybridization，FISH)技術。FISH技術通常利用熒光標記的DNA或RNA探針，來檢測染色體上是否存在相應序列，或者細胞中是否存在特異的RNA分子。在染色質相互作用的研究中，如果同時利用兩個或幾個不同熒光標記的探針，就可以對染色質上兩個或以上特異位點在細胞核內的分布進行定位，從而探討不同位點的接近程度，獲知有關染色體構象的信息。這一技術可以對待測位點的分布進行直觀的顯微觀察，研究單個細胞中相關位點的空間位置關系[3-5]。

最近介紹的一個方法ChrISP(chromatin in situ proximity)，是結合了FISH和原位鄰位連接分析。這種臨位連接分析，最初被用于檢測兩個蛋白質是否位于同一個復合體中(蛋白質相互作用)[6]。Chen et al[7]修飾了該方法，細胞先經甲醛固定，再與以地高辛或生物素標記的探針雜交，然后利用不同的一抗和二抗檢測，其中二抗交聯有不同的寡核苷酸序列。添加的長接頭和熒光標記的短接頭寡核苷酸，當兩個位點間距離小于16.2 nm時，可形成一個熒光標記的環狀DNA分子，從而得到陽性信號。類似的，電鏡技術也可以用于觀察單個細胞中兩個已知位點的相互作用[8], 雖然分辨率很高，但是由于實驗程序比較繁瑣，所以較少應用。

由于受限于已知位點，單次實驗中較少可用的探針，以及分辨率較低，尤其是僅限于研究已知位點的不足，FISH及相關技術一般難于用于檢測未知位點的相互作用以及大規模的基因組水平的研究。但是FISH及其相關技術可為3C數據提供直觀的佐證。

表1研究染色質相互作用的主要技術

技術簡稱原名檢測位點檢測手段主要文獻FISH(熒光原位雜交)Fluorescence in situ hybridiza-tion兩個或少數幾個位點間熒光顯微鏡/共聚焦顯微鏡[3,5,7]3CChromosome conformation cap-ture兩個或少數幾個位點間PCR,瓊脂糖電泳;定量PCR[9,10]4C“circular3C”or “chromosome conformation capture-onchip”特定位點與所有其他位點基因芯片[11,12]5CChromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C)多個位點與多個位點基因芯片或下代測序技術[13]Hi-Ca high-throughput extension of 3C所有位點之間下代測序技術[14]ChIP-3C (ChIP-loop)Chromatin immunoprecipitati-on-3C/loop兩個或少數幾個位點間PCR,瓊脂糖電泳;定量PCR[15,16]ChIA-PETChromatin Interaction Analy-sis by paired-end Tag se-quencing一個蛋白質介導的所有位點之間下代測序技術[5,17,18]

2 3C及其衍生技術

染色體構象捕獲技術(3C)最初是從研究酵母染色體構象中建立起來的[8]，后來在高等哺乳動物細胞株中得到應用和發展，如用于研究人基因組的一些基因座 beta球蛋白，IGF2 印記位點等[19-20]。這一系列技術的發展，是基于一個并不復雜的分子生物學技術，將物理距離靠近的DNA分子在原位進行限制性酶切和臨位連接，再檢測是否有異常DNA分子(線性距離較遠或位于不同染色體上)形成。具體過程如下：對一個細胞群體進行甲醛固定，細胞經限制性內切酶消化或細胞懸浮液經超聲波處理，得到平均長度為2～3個核小體長度的染色質絲。由于轉錄因子、轉錄輔助因子、RNA轉錄復合體等蛋白質之間以及與DNA特定序列之間存在著相互作用，因而形成蛋白質-DNA復合體。而這種相互作用的蛋白質-蛋白質-DNA復合體在適當條件下會在原位被固定下來。再對染色質片段進行連接，從而獲得一個含有各種連接產物DNA片段的文庫(3C文庫)，然后對重新形成的DNA片段進行鑒定、基因組比對和定量分析，獲得染色質不同位點相互接近的頻率，從而推斷染色質的空間位置信息，繪制染色質相互作用圖譜。

3C技術結合其他技術，已經發展出了4C、5C、CHIP-3C/Loop、ChIA-PET和Hi-C等技術(見表1)，這些技術各有特點，后期所用的實驗手段或處理程序不同，能夠鑒定到的相互作用也不同。

常規3C技術可以用來檢測兩個或或少數幾個位點間的相互作用(見表1)。細胞經固定，限制性內切酶或超聲波處理，DNA片段經鄰位連接(構象“捕獲”)，經去交聯和DNA純化，得到包含DNA片段兩端自體連接或不同DNA片段異體連接的3C文庫。3C文庫DNA的檢測主要通過設計位點特異的PCR引物，經PCR擴增后用瓊脂糖凝膠電泳來檢測，或者輔之以Sanger測序來確定，也可以用實時PCR來定量[9-10]。當DNA上線性距離較遠的兩個DNA片段，由于染色體空間構象變化而相互靠近，并被鄰位連接而擴增得到陽性信號。這一方法結合FISH技術，可以為目標位點間的位置關系提供染色質相互作用的確切證據。其不足之處如上所述，由于依賴于特異性擴增(根據已知DNA序列設計引物進而對新形成的融合DNA片段擴增)，所以只能研究少數已知位點間的染色質相互作用。

4C技術與常規3C基本相同，但部分克服了3C檢測少數已知位點的不足。4C技術的一般策略是，細胞經固定后，首先利用限制性內切酶(識別4堿基或6堿基的內切酶)酶切，再用DNA連接酶進行鄰位連接，用于檢測特定的一個已知位點(誘餌位點)與其他位置位點間的相互作用。由于在4C文庫的構建過程中會有一些環狀DNA形成(與3C類似)，因而可以利用已知位點設計引物，通過反向PCR擴增得到與該誘餌位點相互作用的其他染色質位點信息。4C文庫可以通過下代測序技術或基因芯片技術來檢測[21]。4C技術可以比常規3C技術得到更多的染色質相互作用信息，適合于對某一基因座的未知調控元件進行鑒定或對該染色質位點所參與的空間構象進行探討(見表1)。

5C技術因為類似于復制了部分3C文庫(3C-Carbon Copy),因而稱為5C，是基于3C和連接介導的擴增(ligation-mediated amplification,LMA)技術。5C技術是在構建3C文庫的基礎上，通過精心設計兩套引物序列，利用Tag連接酶連接兩個與文庫中DNA精確雜交的引物序列，再通過通用引物序列的擴增，獲得3C文庫中部分相互作用的染色質位點信息，詳細步驟請見[13]。5C曾用于研究beta球蛋白基因座與調控序列間的染色質相互作用，由于需要設計兩套引物，并受限于研究特定的DNA區域，所以應用比較有限。

如果說3C、4C和5C 技術都是探討已知位點與已知或未知的位點的相互作用，從而探討染色體的局部構象，那么在此基礎上建立的Hi-C技術則可以用來檢測基因組水平的部分或所有未知位點之間的相互作用。Hi-C方法也是在3C技術的基礎上建立的。細胞經固定和限制性內切酶酶切，形成的5’突出末端用dNTP(包含生物素化的dCTP)填充，在稀釋的情況下將平頭末端再連接。產物經超聲波處理，含生物素的DNA片段經親和素沉淀(見圖1)。制得的Hi-C文庫，再經雙端高通量測序，分析和基因組序列比對，檢測全基因組染色質間的相互作用位點[14]。Hi-C方法是在基因組水平研究所有染色質位點間可能存在的染色質相互作用關系的技術。獲得的信息非常豐富，一般信號噪音比較高。經過處理后的信息，可以和5C數據一樣以二維熱點圖(heat map)的方式來呈現[14]。

細胞經固定，限制性內切酶酶切，末端用dNTP(包含生物素化的dCTP)填充，連接，超聲波處理，親和素沉淀，雙端高通量測序，分析和基因組序列比對。紅線和藍線表示DNA分子，各種顏色的橢圓表示與DNA結合的各種蛋白質，如深綠色橢圓表示雌激素受體，較大的黃色橢圓表示RNA聚合酶II，黑色線段表示接頭或限制性酶切位點(連接后)，其上的綠色小圓表示生物素分子。圖示兩個發生高頻率染色質相互作用的區域。圖1 Hi-C的主要流程

ChIP-3C或ChIP-loop技術則是結合了ChIP和3C技術，可以研究某一蛋白質介導的染色質之間相互作用，如雌激素受體或RNA聚合酶II等轉錄因子介導的增強子-啟動子間的相互作用[5,16]。ChIP-3C一般是在利用某一特異性抗體進行染色質免疫沉淀的過程中，對免疫復合物中的DNA片段進行鄰位連接，再經去交聯和DNA純化，可以得到特定蛋白質介導的染色質相互作用的3C文庫。其檢測方法與前述3C文庫的相同。不足之處是對于每一個染色質間的相互作用，都需要設計相應的引物來擴增并分析。

同Hi-C技術一樣，ChIA-PET技術也是在基因組水平檢測全新的染色質相互作用的技術。ChIA-PET是我們首先用雌激素受體陽性的人乳腺癌細胞MCF7建立起來的，后來在小鼠、干細胞等材料中也得到了應用[5,17]。利用不同的ChIP 級的特異性抗體，針對雌激素受體和RNA聚合酶II等，可以探測到以該被檢測蛋白為錨定點介導的基因組水平染色質相互作用。ChIA-PET技術與ChIP-3C技術在前期的樣品制備過程基本相同，如細胞經固定、超聲波處理和染色質免疫沉淀。此后，ChIP產物在稀釋后(目的是為了降低非特異性臨位連接產物)，連接生物素化的接頭(含MmeI位點)，DNA-蛋白質復合體經65℃去交聯，DNA經純化，MmeI消化，親和素交聯的磁珠沉淀。制得的ChIA-PET文庫，經高通量測序，分析和基因組序列比對，就可以繪制如雌激素受體介導的全基因組染色質纖維相互作用的位點(見圖2)。ChIA-PET通過鑒定增強子-啟動子間相互作用而形成的環狀結構，可以同時鑒定某一時刻所有與目標基因位置靠近的增強子或其他DNA調控元件[5,17]。

細胞經固定，超聲波處理，抗體免疫沉淀，用生物素化的ChIA-PET接頭(含MmeI位點)連接。再經MMeI酶切，用鏈霉親合素交聯的珠子純化重新連接的DNA分子。然后加上雙末端測序接頭，擴增，測序，基因組比對，鑒定蛋白質在DNA上的結合位點及染色質長程相互作用。紅線和藍線表示DNA分子，各種顏色的橢圓表示與DNA結合的各種蛋白質，如深綠色橢圓表示雌激素受體，較大的黃色橢圓表示RNA聚合酶II，黑色線段表示接頭，其上的綠色小圓表示生物素分子。圖示檢測到的兩個染色質位點間的相互作用。圖2 ChIA-PET的主要流程

ChIA-PET與Hi-C的主要不同點有：一是Hi-C沒有ChIP這一步，因而不受限于ChIP級別的特異性抗體；二是兩者在初次連接DNA片段時所用的接頭不同，因而制備文庫的策略不同；三是ChIA-PET只能檢測到細胞群體中以與DNA結合的某一蛋白質所介導的所有的染色質位點間的相互作用，而Hi-C理論上可以捕捉到一定的細胞群體中所有的染色質位點間的相互作用，包括轉錄因子介導的以及染色質與染色質間直接的相互作用。對于染色質上不同位點間的相互作用頻率而言，由于同一染色質上的順式相互作用遠遠高于不同染色質上的反式相互作用(cis-trans ratio ，CTR)，以及作用強度隨距離而衰減(distance-dependent decay, DDD)，這就使得Hi-C技術的分辨率目前只能達到0.1到1 Mb[14]或者5-10kb[22]。而ChIA-PET通過染色質免疫沉淀一步消除了大量非特異性的相互作用信號，所以理論上的分辨率應該為實驗中能區分的DNA上臨近的兩個蛋白質結合位點。3C技術結合目前的高通量下代測序技術，已經逐漸成為研究染色質間相互作用的主流方向。因為ChIA-PET和Hi-C技術是目前在基因組水平探討和鑒定染色質長程相互作用的最主要技術，因此我們重點回顧利用這兩個技術獲得的主要進展。

3 染色體構象與基因表達及染色體三維構象

3.1 雌激素受體介導的染色質間相互作用 雌激素受體(EstrogenReceptors,ERs)是核受體家族的一員，ERs在發育、正常生理、病理過程中起著重要作用，因此研究ERs介導的基因調控機理對于深入研究相關疾病具有重要意義。最初不同研究組利用不同的方法對雌激素受體α(ERα)在基因組中的結合位點進行定位時，發現大多數結合位點都分布在遠離基因啟動子的5kb以上的地方[23-24],因此如何界定這些潛在的調控元件所控制的特定基因，成為研究雌激素信號通路的一個挑戰。以TFF基因為例，我們證實在其上游10.5kb的一個ERα結合位點在促進TFF1基因的表達中起著關鍵作用，通過形成增強子-啟動子環狀結構相互作用，從而促進其高表達[16,25]。常規的這類研究DNA調控序列的方法，每次只能針對少量位點，比較費時費力。為了探討這些基因組范圍內ERα結合位點所調控的基因，CHIA-PET技術應運而生[5]。利用MCF7 細胞，在初次實驗中從兩個文庫中各鑒定到1475個和3561個相互作用，前100個相互作用中有80% 是相同的?？偣茶b定了至少689 ERα 結合的染色質相互作用區域(兩次實驗能重復得到的數據。這一方面表明染色質相互作用的動態性，一方面表示那些強的相互作用相對而言比較容易被捕捉到。隨著進行更深度的測序，已檢測到更多的相互作用(未發表數據)。對于鑒定與基因轉錄調控有關的未知的DNA調控元件來說，CHIA-PET技術目前而言仍是最為高效的方法。ERα介導的染色質相互作用與基因表達有著密切的關系。在錨定點附近的基因，多數呈活躍表達狀態，而環內基因則呈現被抑制趨勢。所以這種染色質相互作用，可以促進一些基因的表達，同時也抑制另外一些基因的活性[5,26]。

另一發現是，ERα與特異的雌激素反應元件的結合及其介導的染色質相互作用，需要FoxA1和AP2γ的參與[27-28]。61%的雌激素受體結合位點有FoXA1和AP2γ[28]。在這種雌激素介導的信號傳導過程中，AP2γ可能和FoxA1一樣，起著前驅因子的作用。所以目前我們認為ER介導的染色質長程相互作用的機理，可能如圖3所示[28]。

沒有雌激素(E2)時，ERα調控的基因不表達或低表達。當有E2存在時，E2進入細胞質，與ERα結合，進入細胞核內，與FoxA1(F)和AP2γ(A)等作用結合在雌激素反應元件上，并與其他轉錄因子作用，與啟動子發生染色質相互作用，激活RNA聚合酶II(RNAP II)的轉錄活性，從而促使目標基因表達。P,p300/CBP;T,TFIID;M,Mediator。 圖3 雌激素受體ERα介導的染色質長程相互作用模型

3.2 RNA聚合酶II介導的染色質間相互作用 RNA聚合酶II對mRNA,snRNA和許多microRNA的轉錄起著關鍵作用。各種轉錄因子如ERα等介導的染色質長程相互作用，很多都和啟動子區的RNA聚合酶II有關，所以基因組水平的RNA聚合酶II介導的染色質長程相互作用也是很重要的一方面，這種相互作用最初在MCF7中得到了確認。起初鑒定到了RNA 聚合酶II介導的12,626相互作用，隨著深度測序，得到了成倍的——24,126個相互作用[18]。Li 等探討了包括MCF7等5種細胞株中RNA 聚合酶II相關的啟動子可以作為染色質相互作用的關鍵錨點。而啟動子-啟動子相互作用對于多數臨近基因的表達有促進作用[18]。這表明傳統意義上的啟動子在染色質相互作用的環境下可以在某種程度上扮演增強子的作用。

類似的發現也存在于3種小鼠細胞類型中，并且與干細胞的分化過程有關。Zhang 等[29]比較了處于不同分化程度的3種小鼠細胞：胚胎干細胞(embryonic stem cells ，ESCs), 神經干細胞(neural stem cells，NSCs)和神經祖細胞(neurosphere stem/progenitorcells，NPCs)中RNA聚合酶II介導的相互作用，總共檢測到40 000 個染色質長程相互作用。當啟動子定義為距離轉錄起始位點+/- 2.5堿基對時，一半的染色質相互作用表現為啟動子-啟動子之間，另外的表現為啟動子-基因內增強子或啟動子-基因間增強子。這種相互作用表現出很強的細胞特異性。并在3種細胞株中分別鑒定了8,309, 4,463 和3,649個潛在的遠距離DNA調控元件。

Kieffer-Kwon等也有類似的發現，小鼠多能胚胎干細胞和已分化的B淋巴細胞基因組中有不同的增強子和啟動子之間相互作用的圖譜，而且也發現胚胎干細胞和已分化的B淋巴細胞中，活躍表達的基因，例如Myc和Pim1等，在兩種細胞中使用著不同的增強子組。這也表明增強子和啟動子的相互作用，增加了基因轉錄調控的復雜性并表現出細胞發育階段的特異性[30]。但是對于外源激素刺激的信號傳導過程研究，表明這種增強子-啟動子之間的染色質位點間的相互作用，在外源激素刺激前，就已經存在。Jin等用Hi-C研究了TNF-α 信號通路中，NF-κB介導的啟動子-增強子的相互作用。他們發現這種相互作用的成環結構，在TNF-α 信號傳遞前就已存在。而且這種相互作用也在IFN-γ, TNF-α, β-estradiol和5α-dihydrotestosterone處理的不同細胞中預先存在[22]。這與我們早期在雌激素(β-estradiol)介導的染色質相互作用中的研究并不完全一致。造成這種差異的原因以及這種預先成環結構的存在是否具有普遍意義，值得進一步探討。

3.3 CTCF介導的染色質間相互作用 早期的研究發現，CTCF(CCCTC-binding factor，CTCF)是特異性地與DNA上的CCCTC序列結合的蛋白，因為可以阻斷增強子對基因的作用，具有絕緣子或隔離子特性，所以又稱為轉錄阻抑蛋白(Transcriptional repressor CTCF)。CTCF在基因轉錄調控，染色質三維結構的組織中起著十分關鍵的作用[31-32]。Handoko等用ChIA-PET技術，研究了CTCF在小鼠胚胎多能干細胞中的結合位點和介導的染色質相互作用[31]。結果表明CTCF在建立和維持染色質的局部構象，調節基因簇的協同表達，介導DNA調控元件與啟動子的相互作用，以及染色體局部的構象等方面發揮著重要作用。他們綜合所有CTCF的ChIA-PET文庫，得到了1480個順式和336個反式染色質相互作用。一部分CTCF介導的染色質相互作用錨定點與p300的結合位點一致，而p300是轉錄激活因子。降低CTCF蛋白質水平及其介導的染色質相互作用，相應降低了該區域的基因轉錄水平，從而揭示在一些情況下CTCF可以阻斷增強子的活性，而有時也可以通過介導這種相互作用，使p300等轉錄因子與特定基因的啟動子發生長程相互作用，從而激活基因的轉錄活性。DNA的核纖層結合域(Lamin-associated domains，LADs)兩側，常見CTCF環狀結構。CTCF通過扮演隔離子的角色，限定LADs局部區域，使LAD區域內的基因呈現低表達狀態。同時，CTCF的分布與組蛋白的修飾也密切相關，如H3K4me1和H3K27me3的分布與 CTCF的結合位點高度相關，H3K36me3 呈高度負相關[33-34]。類似的結果也在SMC1A，一個Cohesin復合體的亞基參與的小鼠研究中被證實[35]。Cohesin與CTCF常相互作用，是功能密切相關的蛋白質。Cohesin介導的相互作用影響細胞干性基因表達，與維持細胞的多能性密切相關[36-37]。因而Cohesin/CTCF介導的染色質相互作用是在不同組織中基因特異表達的一種基本調控機制。

Zuin et al[38]2013 探討了CTCF和Cohesin復合體在染色體高級組織結構中的作用，證實與CTCF 和Cohesin對于染色體拓撲結構有不同的作用。Cohesin更多參與距離較短的染色質位點間的相互作用，而CTCF既參與距離較短的染色質位點間的相互作用，也參與臨近拓撲結構域之間的相互作用。分別降低兩者的蛋白質水平會引起不同的染色體拓撲結構的變化，也相應引起了不同的基因表達譜的變化。

如果比較CTCF和ERα介導的染色質相互作用，我們會發現二者介導的染色質相互作用對基因的轉錄調控，并非單一方向的，而是具有雙向調節作用。既可以抑制被調控的基因，也可以促進一些基因的活性。另外ERα介導的染色質長程相互作用形成的環內基因有一定程度的抑制，也說明雌激素受體除了作為積極參與轉錄調控以外，還可以通過介導染色質的相互作用而表現出和CTCF相同的功能，即對染色體進行區域化分隔，從而在染色體高級結構層次對基因表達進行調控。

3.4 染色質相互作用與染色質在細胞核內的空間組織 關于染色質絲在細胞核內的組織，有多種模型被提出，如有分形小球(fractal globule)，平衡小球(equilibrium globule)等模型,其中染色質絲的分形小球模型獲得了一些實驗數據的支持[39]。分形小球模型主要指多聚體在凝聚而形成的一種致密的狀態，由于拓撲結構的限制,不會在鏈內部形成“結狀”結構。Dekker研究組根據以上這些相互作用的頻率及其位點間的距離判斷，在百兆堿基對的尺度上，染色質線在細胞核中的分布更符合分形球狀模型,而不是以前認為的平衡球狀模型[14]。

關于染色體在細胞核內的組織以及對于染色體不同結構域的定義仍沒有統一。但一般認為，每條染色體在細胞核內占據著一定的區域，而每條染色體由于不同的結構域組成。染色體不是隨機雜亂分布的，而是遵循著一定的規律[40-43]。如Cremer 等認為，在間期細胞核中，染色體領域(chromosome territories, CTs)是一個細胞核結構的一個基本的特征[40]。對少量的染色體部分的研究表明，尺度大約為1Mb的染色體片段是組成染色體域的基本單位[40,44]。他們認為染色體領域在光鏡下表現為吉姆薩染色后的深染染色質團塊。而這些1Mb的染色質域又是由小的環狀染色質域組成的[40]。

而最近Dekker和Lander 等合作用lymphoblastoid和K562細胞得到了染色體長程相互作用資料[42]。他們認為每條染色體在細胞核內占據著一定的區域(Chromosome Territories，CTs),即每條染色體占據著的核內區域為其染色體領域(圖4 扇形部分)。同時，每條染色體從空間分布上可以大致分為兩種次級結構域——區隔(compartment A or B)。其中一種區隔基因密度較高，染色體多呈開放狀態(見圖4中A區隔)；而另一類基因密度較低，染色體構象較致密(見圖4中B區隔)。有數據表明大約5Mb的區隔A和B沿著染色質絲分布，區隔間可以發生染色質的相互作用，一般A傾向于與A作用，B傾向于與B作用，雖然來自不同區隔中的位點相互作用頻率較低。而區隔是由若干個染色體拓撲聯合域(topologically associating domains ，TADs)組成。每個區隔內的一系列染色質位點可以發生頻率較高的相互作用(見圖4)。

圖示間期細胞核中一條染色體的局部放大。扇形區域表示一個放大的染色體領域(CT)。圓A和B表示染色體的兩個相鄰區隔(CC)，其中A表示比較活躍的基因比較多的區域，而B表示不太活躍基因密度較低的部分，分別大概5Mb左右。A和B分別有數個拓撲聯合域(TADs)組成，每個拓撲聯合域約500kb。其中的部分拓撲結構域用紅色或藍色圈表示(CTCF在全基因組都有分布，但在拓撲聯合域之間有較多分布，圖中未標示)。圖4 間期細胞核中染色質的局部構象

21號染色體大小為48Mb，如果假設每個拓撲聯合域為500kb,每10個拓撲聯合域組成一個區隔，則最小的21號染色體就由近10個區隔組成。而最大的1號染色體(249Mb)由大約50個區隔組成。當然實際情形要比這復雜得多，不僅因為這些拓撲聯合域和區隔等次級域的大小不是均勻的，而且因為染色體也是動態的。

4 3C及其衍生技術的應用前景

3C技術自從建立以來，已經發展得比較成熟了，尤其以ChIA-PET和Hi-C技術為代表，但也有一些不足之處。由于這些結果都是來自于許多細胞組成的樣品，即基于對細胞群體的實驗和統計分析，因而難于估計不同細胞中的即時的染色質相互作用和染色質組織特點。如何解析單個細胞中的染色質相互作用和染色體的空間組織，以及在發育過程中，或者疾病發生發展過程中染色質相互作用和基因組結構的動態變化，仍是研究的難點。另外，3C技術由于臨近染色體的隨機靠近，捕獲的信號會湮沒那些特征性的比較穩定的染色質位點間的聯系。尤其是如何降低Hi-C技術的噪音，提高靈敏度也是需要關注的。不過，盡管有一些不足，3C技術仍然是很有用的基因組學研究工具。

首先，可以通過特定的轉錄相關蛋白質的免疫沉淀，用于鑒定未知的與基因調控表達有關的重要序列，是否與基因啟動子區存在著相互作用。當然，利用3C技術獲得的染色質相互作用，對于他們是否具有增強子的作用或其他功能，還需要通過其他實驗，如熒光素酶報告基因實驗，轉基因斑馬魚、TALENs或CRISPR/Cas等基因組編輯工具來檢驗。

其次，全基因組水平的染色質特異以及非特異的相互作用數據，將會為進一步解析染色質在細胞核內的組織結構提供豐富的資料。如腫瘤的發生發展一般是一個長期復雜的過程，不僅與若干個基因突變有關，在某些腫瘤中，還常伴隨著染色體結構的改變，如染色體倍性的改變，染色體片段的增加，缺失及易位，基因的擴增等。這些染色體一級結構的改變，是否以及如何影響到染色體高級構象的變化，是一個值得探討的問題。如在ICF綜合癥(Immunodeficiency-centromeric instability-facial anomalies syndrome)中, DNA甲基化的改變影響到了染色體領域的變化。類似的， 3C技術無疑也可以用于研究在一些病理變化過程中,染色體的三維構象是否呈現特異性的的變化，是否可以成為相關疾病的特征性標志。

另外，3C數據不僅可以用于研究染色體的高級結構，也可以用于研究基因組的線性序列。如最近Kaplan等[45]利用染色質相互作用強度表現為“順式”和“近距離較強”的特性，利用Hi-C技術預測和拼接一些尚未連接的人類基因組或其他基因組的缺口區域。

最后，這些技術也可以用于單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms ，SNPs)的相關研究。比如可以通過探討有統計學意義的與疾病相關的已知SNPs位點，是否參與染色質位點之間的相互作用，進而參與基因的調控，從而鑒別基因本體以外的與疾病相關的SNPs并探討其可能的功能。

總之，隨著未來建立在3C基礎之上的實驗技術的繼續發展和應用，以及相應計算技術的開發，我們無疑會得到豐富的染色質相互作用的資料，這些資料必將極大促進功能基因組的研究。

[參考文獻]

[1] Luger K, Mader A W, Richmond R K, et al.Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution [J]. Nature, 1997,389(6648):251-260.

[2] Olins D E, Olins A L. Chromatin history: our view from the bridge[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2003,4(10):809-814.

[3] Lanzuolo C, Roure V, Dekker J, et al. Polycomb response elements mediate the formation of chromosome higher-order structures in the bithorax complex[J]. Nat Cell Biol，2007, 9(10)：1167-1174.

[4] Matarazzo M R, Boyle S, D’Esposito M,et al. Chromosome territory reorganization in a human disease with altered DNA methylation[J].Proc Natl Acad Sci USA，2007,104(42):16546-16551.

[5] Fullwood M J, Liu M H, Pan Y F, et al.An oestrogen receptor α-bound human chromatin interactome[J].Nature,2010, 462(7269):58-64.

[6] S?derberg O, Gullberg M, Jarvius M, et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation[J].Nat Methods,2006,3(12):995-1000.

[7] Chen X, Shi C, Yammine S, et al. Chromatin in situ proximity (ChrISP): single-cell analysis of chromatin proximities at a high resolution[J].Biotechniques,2014,56(3):117-124.

[8] Su W, Porter S, Kustu S, et al. DNA-looping and enhancer activity?: Association between DNA-bound NtrC activator and RNA polymerase at the bacterial ginA promoter[J].Proc Nati Acad Sci USA,1990,87(14):5504-5508.

[9] Dekker J, Rippe K, Dekker M, et al. Capturing chromosome conformation[J].Science，2002,295(5558):1306-1311.

[10] Hagège H, Klous P, Braem C, et al. Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR)[J]. Nat Protoc,2007, 2(7):1722-1733.

[11] Simonis M, Kooren J, de Laat W. An evaluation of 3C-based methods to capture DNA interactions[J].Nat Methods,2007, 4(11):895-901.

[12] Zhao Z, Tavoosidana G, Sj?linder M, et al. Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions[J].Nat Genet,2006, 38(11):1341-1347.

[13] Dostie J, Richmond T A, Arnaout R A, et al. Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): a massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements[J].Genome Res,2006, 16(10):1299-1309.

[14] Lieberman-Aiden E, van Berkum N L, Williams L, et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome[J].Science,2009, 326(5950):289-293.

[15] Horike S, Cai S, Miyano M, et al. Loss of silent-chromatin looping and impaired imprinting of DLX5 in Rett syndrome[J].Nat. Genet,2005, 37(1):31-40.

[16] Pan Y F, Wansa K D, Liu M H, et al. Regulation of estrogen receptor-mediated long range transcription via evolutionarily conserved distal response elements[J].J Biol Chem,2008,283(47):32977-32988.

[17] Li G, Fullwood M J, Xu H, et al. ChIA-PET tool for comprehensive chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing[J].Genome Biol,2010, 11(2):R22.

[18] Li G, Ruan X, Auerbach R K,et al.Extensive promoter-centered chromatin interactions provide a topological basis for transcription regulation[J].Cell,2012 ,148(1-2):84-98.

[19] Tolhuis B, Palstra R J, Splinter E, et al.Looping and interaction between hypersensitive sites in the active beta-globin locus[J]. Mol Cell,2002,10(6):1453-1465.

[20] Murrell A, Heeson S, Reik W. Interaction between differentially methylated regions partitions the imprinted genes Igf2 and H19 into parent-specific chromatin loops[J].Nat Genet,2004, 36(8): 889-893.

[21] Wei Z, Gao F, Kim S, et al. Klf4 organizes long-range chromosomal interactions with the oct4 locus in reprogramming and pluripotency[J].Cell Stem Cell ,2013,13(1):36-47.

[22] Jin F,Li Y, Dixon J R, et al. A high-resolution map of the three-dimensional chromatin interactome in human cells[J].Nature,2013 ,503(7475):290-294.

[23] Carroll J S, Meyer C A, Song J, et al. Genome-wide analysis of estrogen receptor binding sites[J].Nat Genet,2006, 38(11):1289-1297.

[24] Lin C Y, Vega V B, Thomsen J S, et al.Whole-Genome Cartography of Estrogen Receptor α Binding Sites[J].PLoS Genet,2007, 3(6): e87.

[25] Theodorou V, Carroll J S. Estrogen receptor action in three dimensions - looping the loop[J].Breast Cancer Res,2010, 12(1):303.

[26] Chepelev I, Wei G, Wangsa D, et al. Characterization of genome-wide enhancer-promoter interactions reveals co-expression of interacting genes and modes of higher order chromatin organization[J].Cell Res，2012, 22(3):490-503.

[27] Carroll J S, Liu X S . Chromosome-wide mapping of estrogen receptor binding reveals long-range regulation requiring the forkhead protein FoxA1[J].Cell，2005, 122(1):33-43.

[28] Tan S K, Lin Z H, Chang C W, et al. AP-2γ regulates oestrogen receptor-mediated long-range chromatin interaction and gene transcription[J].EMBO J，2011, 30(13):2569-2581.

[29] Zhang Y,Wong C H,Birnbaum R Y, et al.Chromatin connectivity maps reveal dynamic promoter-enhancer long-range associations [J].Nature,2013,504(7479),306-310.

[30] Kieffer-Kwon K R,Tang Z,Mathe E,et al.Interactome maps of mouse gene regulatory domains reveal basic principles of transcriptional regulation[J]. Cell，2013, 155(7):1507-1520.

[31] Cuddapah S, Jothi R, Schones D E, et al.Global analysis of the insulator binding proteinCTCFin chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains[J]. Genome Res，2009, 19(1):24-32.

[32] Ong C T, Corces V G.CTCF: an architectural protein bridging genome topology and function[J].Nat Rev Genet，2014, 15(4):234-246.

[33] Handoko L, Xu H, Li G, et al. CTCF-mediated functional chromatin interactome in pluripotent cells[J].Nat Genet，2011, 43(7):630-638.

[34] Lee B K, Iyer V R. Genome-wide studies of CCCTC-binding factor (CTCF) and cohesin provide insight into chromatin structure and regulation[J]. J Biol Chem，2012, 287(37):30906-30913.

[35] De Mare L E, Leng J, Cotney J, et al. The genomic landscape of cohesin-associated chromatin interactions[J].Genome Res，2013, 23(8):1224-1234.

[36] Zhang H, Jiao W, Sun L, et al. Intrachromosomal looping is required for activation of endogenous pluripotency genes during reprogramming[J].Cell Stem Cell ，2013, 13(1):30-35.

[37] Sexton T, Cavalli G. The 3D genome shapes up for pluripotency[J].Cell Stem Cell .2013, 13(1):3-4.

[38] Zuin J, Dixon J R, van der Reijden M I, et al. Cohesin and CTCF differentially affect chromatin architecture and gene expression in human cells[J].Proc Natl Acad Sci USA，2014, 111(3):996-1001.

[39] Mirny L A. The fractal globule as a model of chromatin architecture in the cell[J].Chromosome Res，2011, 19(1):37-51.

[40] Cremer T, Cremer M. Chromosome territories[J].Cold Spring Harb Perspect Biol ，2010, 2(3):a003889.

[41] Marti-Renom M A, Mirny L A. Bridging the resolution gap in structural modeling of 3D genome organization[J]. PLoS Comput Biol，2011, 7(7):e1002125.

[42] Dekker J, Marti-Renom M A, Mirny L A. Exploring the three-dimensional organization of genomes: interpreting chromatin interaction data[J].Nat Rev Genet，2013, 14(6):390-403.

[43] Gibcus J H, Dekker J. The hierarchy of the 3D genome[J].Mol Cell ，2013, 49(5):773-782.

[44] Cope N F, Fraser P, Eskiw C H. The yin and yang of chromatin spatial organization[J].Genome Biol，2010, 11(3):204.

[45] Kaplan N, Dekker J. Nat Biotechnol. High-throughput genome scaffolding from in vivo DNA interaction frequency[J].Nature Biotechnol，2013, 31(12):1143-1147.