高脂血癥大鼠hepcidin 的表達異常及川芎嗪的干預研究

孫明月 郭春雨 王景尚 劉 欣 張 淼 王 琳 殷惠軍

高脂血癥是由脂質代謝或運轉異常引起的全身性慢性炎性疾病，在動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的發生、發展中起著重要作用。鐵調素(hepcidin)是一種由肝細胞分泌后釋放入血漿經尿液排出的細胞因子誘導的抗菌蛋白，它是鐵經腸黏膜吸收、由巨噬細胞回收、轉移至肝儲存的自我平衡調節器，在鐵代謝中起關鍵作用。

已有動物實驗證明［1］，鐵過負荷可引起小鼠的血脂代謝紊亂，但血脂代謝異常是否會對hepcidin 的表達產生影響從而影響AS 的進程，尚未有充分的研究說明。肝素除抗凝作用外，還可通過抑制平滑肌細胞遷移和增殖、調節血脂代謝、保護血管內皮等作用以抑制動脈粥樣硬化的發生、發展［2］。Poli 等［3］發現，肝素可通過抑制BMP/SMAD 及JAK/ STAT 兩條通路從而抑制hepcidin 的表達，故本次研究采用肝素作為陽性對照。

川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)是中藥川芎的根莖中提取的有效成分，化學結構為四甲基吡嗪，具有保護血管內皮、抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗激素硬化及抗血小板等作用，臨床上廣泛用于心腦血管疾病的治療［4］。因川芎嗪對HepG2 細胞的增殖具有抑制作用，且本課題組前期已證實川芎嗪對HepG2 細胞內的hepcidin 具有抑制作用，故本次實驗選用川芎嗪并研究其對體內hepcidin 表達的影響，觀察其抗動脈粥樣硬化的作用是否與hepcidin 的表達有關，并探索其機制［5］。本研究通過給予高脂飲食大鼠不同處理后觀察血清hepcidin 表達的變化，探討高脂血癥對大鼠血清hepcidin 表達的影響及川芎嗪對其干預作用，為高脂血癥的發病機制及防治提供新的思路及科學依據。

材料與方法

1.研究對象:實驗動物:SPF 級雄性SD 大鼠40 只，體重180 ～200g，4 周齡，購自北京斯貝福實驗動物中心(許可證號:SCXK 京2011 -0004)。飼料:普通飼料購自北京科澳協力飼料有限公司，高脂飼料購自北京諾康源生物科技有限公司，配方為1%膽固醇、0.2%膽酸鹽、10%豬油、10%蛋黃粉及78.8% 基礎飼料。

2.試劑及儀器:藥物:鹽酸川芎嗪注射液(北京市永康藥業有限公司，批號:13070401)，肝素鈉注射液(常州千紅生化制藥股份有限公司，批號:130608)。主要試劑:生化檢測甘油三酯(TG)及膽固醇(TC)試劑(購于北京萬泰德瑞診斷技術有限公司，批號分別為:ZL3103AA21 及ZL3103AA22)，大鼠血清鐵調素(hepcidin)、腫瘤壞死因子-α(TNF -α)、白細胞介素1(IL -1)及白細胞介素6(IL -6)ELISA 試劑盒(購于AMEKO 公司，批號:201312)。主要儀器:UV-2000 型紫外分光光度計(上海市尤尼柯公司)，352 型酶標儀(芬蘭Labsystems Multiskan MS 公司)，AC8 型洗板機(芬蘭Thermo Labsystems 公司)，GNP-9080 型隔水式恒溫培養箱(國產)，高速冷凍離心機(Sigma 3 -18k)，CS -T300 型全自動生化分析儀(長春迪瑞醫療科技股份有限公司)。

3.方法:(1)高血脂癥模型的制備:40 只大鼠均適應性喂養普通飼料1 周后，隨機抽取10 只以普通飼料喂養8 周設為空白對照組。將剩余30 只隨機分為3 組，每組10 只，均以高脂飼料喂養8 周。(2)分組及給藥:空白對照組及模型組大鼠喂養8 周后，給予生理鹽水2ml/(kg·d)腹腔注射;肝素陽性對照組高脂喂養8 周后給予肝素鈉注射液5mg/(kg·d)腹腔注射;川芎嗪組高脂喂養8 周后給予鹽酸川芎嗪注射液40mg/(kg·d)腹腔注射，各組注射均連續7 天。所有大鼠在高脂和普通飼料分組后，實驗過程中飼養條件不發生改變。(3)取材:空白對照組及模型組大鼠于喂養4 周時，分別于眼眶取血2ml，在室溫下靜置1h 后，經過高速冷凍離心機離心，3000r/min，離心15min，吸取上層血清，待測。各組大鼠添加藥物7 天后，禁食不禁水8h，7%水合氯醛5ml/kg 腹腔注射，在麻醉狀態下沿腹正中線切開胸腹部，推開腹腔臟器，暴露腹主動脈，10ml 注射器穿刺取血置于促凝采血管中，并將在取血時發生凝血、溶血的血樣廢棄，其中包括空白對照組2 只、模型組3 只、肝素組2 只及川芎嗪組2 只大鼠的血樣，其余于室溫靜置1h 后高速冷凍離心機離心，3000r/min，離心15min，吸取上層血清，待測。取血后立即分離肝臟，根據標準組織切片技術，固定于4%多聚甲醛中。

4.各項指標的測定:大鼠血清測定以下指標:全自動生化分析儀測定血脂指標，包括TG、TC;大鼠血清hepcidin、TNF -α、IL -1 及IL -6，測定方法及步驟按試劑盒說明書進行操作。

5.肝組織病理學檢測:肝組織固定7 天后，進行石蠟包埋，制作組織切片及HE 染色，用于肝組織形態學觀察。

6.統計學分析:采用SPSS 19.0 軟件進行統計學處理，各項檢測指標中服從正態分布者以均數±標準差(±s)表示，兩組組間比較采用獨立樣本t 檢驗，多組均數之間的差異顯著性檢驗采用單因素方差分析，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1.各組大鼠血脂水平比較:與空白對照組(9 周)相比，模型組(9 周)、肝素對照組及川芎嗪組的血清膽固醇均升高，模型組(9 周)及川芎嗪組的甘油三酯均升高(P ＜0.05);與空白對照組(4 周)相比，模型組(4 周)的血清膽固醇升高(P ＜0.05)，詳見表1。

表1 各組大鼠血清TC、TG 水平的比較(±s)

表1 各組大鼠血清TC、TG 水平的比較(±s)

與空白對照組(9 周)比較，#P ＜0. 05;與模型組(9 周)比較，* P ＜0.05

組別 時間(周) n TC(mmol/L) TG(mmol/L)空白對照組 4 10 1.77 ±0.14* 0.94 ±0.38*空白對照組 9 8 2.07 ±0.18* 1.03 ±0.27*模型組 4 10 2.31 ±0.36* 0.95 ±0.26*模型組 9 7 3.73 ±0.45# 1.32 ±0.10#肝素對照組 9 8 3.55 ±0.53# 1.28 ±0.12*川芎嗪組 9 8 3.62 ±0.86# 1.31 ±0.28*

2.肝組織病理改變:HE 染色后鏡下可見，空白對照組的肝小葉和肝細胞索結構清晰，細胞排列整齊，細胞中央有大而圓的核，細胞質均勻;模型組肝組織小葉結構欠清，明顯可見彌漫性大小不一的圓形脂肪空泡，伴有水樣變性、炎性細胞浸潤及凋亡的肝細胞;肝素組及川芎嗪組的脂肪樣變則明顯改善，見圖1。

圖1 肝組織病理改變(HE，×200)

3.川芎嗪對高脂血癥大鼠血清hepcidin 的影響:與空白對照組(4 周)比較，模型組(4 周)的hepcidin的表達升高(P ＜0.05);與空白對照組(9 周)比較，模型組(9 周)hepcidin 表達顯著升高(P ＜0.05);與模型組(4 周)比較，模型組(9 周)hepcidin 表達的值升高(P ＜0.05);肝素對照組與川芎嗪組hepcidin 表達的值與空白對照組(9 周)比較，差異無統計學(P ＞0.5);與模型組(9 周)比較，肝素對照組與川芎嗪組hepcidin 表達的值均降低(P ＜0.05)，詳見表2。

4.川芎嗪對高脂血癥大鼠血清TNF -α、IL -1及IL-6 的影響:與空白對照組(9 周)相比，模型組(9周)的血清TNF - α、IL -1及IL -6均升高(P ＜0.05);與模型組(9 周)相比，肝素對照組與川芎嗪組的血清TNF-α、IL -1 及IL -6 均降低(P ＜0.05)，詳見表3。

表2 各組血清hepcidin 的比較(±s)

表2 各組血清hepcidin 的比較(±s)

與空白對照組(9 周)比較，* P ＜0.05;與模型組(9 周)比較，#P ＜0.05

組別 時間(周) n hepcidin(μg/L)空白對照組 4 10 130.90 ±12.90#空白對照組 9 8 132.76 ±13.24#模型組 4 10 138.95 ±20.88#模型組 9 7 156.51 ±24.95*肝素對照組 9 8 121.17 ±13.34#川芎嗪組 9 8 127.74 ±14.98#

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-1 及IL-6 的比較(±s)

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-1 及IL-6 的比較(±s)

與空白對照組(9 周)比較，* P ＜0.05;與模型組(9 周)比較，#P ＜0.05

組別 時間(周) n TNF-α(ng/L) IL-1(ng/L) IL-6(ng/L)空白對照組 9 8 52.75 ±7.88# 179.31 ±15.78# 28.32 ±0.90#模型組 9 7 58.99 ±4.39* 199.11 ±12.64* 32.76 ±0.94*肝素對照組 9 8 50.86 ±9.08# 166.38 ±21.58# 25.00 ±1.25#川芎嗪組 9 8 52.13 ±9.14# 173.24 ±25.80# 27.85 ±0.90#

討 論

機體鐵穩態對生命體的新陳代謝平衡起至關重要的作用，hepcidin 對于鐵穩態的維持有著重要的意義，有許多疾病的致病機制也與hepcidin 的異常表達相關。研究顯示，調控hepcidin 表達的信號通路中較重要的是轉化生長因子超家族的BMP/SMAD 信號通路以及JAK /STAT 信號通路，炎性因子可通過JAK /STAT 信號通路來調控hepcidin 的表達，且JAK/STAT 通路對hepcidin 的調控依賴于SMAD4 的存在［6］。

隨著鐵代謝與AS 的相關性研究逐漸增多，鐵在AS 進展中的促進作用已得到證實，主要表現為:在AS 的初期就已出現斑塊內鐵沉積增多，通過限鐵飲食或鐵螯合劑治療則可減少鐵沉積、改善AS 及斑塊的穩定性。而hepcidin 可在AS 的斑塊中高表達，主要表達于巨噬細胞及平滑肌細胞，其可促進斑塊的不穩定性，并使巨噬細胞內的鐵沉積增多［7，8］。通過以上所述，可知hepcidin 與AS 斑塊內的鐵沉積及斑塊穩定性密切相關，但尚未有研究探索AS 發生、發展中血清hepcidin 的表達情況及其機制。

本研究通過建立高脂模型，觀察血脂變化對血清hepcidin 表達的影響;采用已知對hepcidin 有明顯抑制作用的肝素做為陽性對照，觀察川芎嗪對高脂大鼠hepcidin 表達的影響。通過對不同時間段的血脂及血清hepcidin 的檢測發現，與空白對照組(9 周)比較，模型組(9 周)、肝素對照組與川芎嗪組的血脂均升高，說明肝素及川芎嗪對血脂無明顯降低作用，而血清hepcidin 的表達隨著血脂的升高而升高，此結果表明血清hepcidin 的表達與血脂升高呈正相關，與此同時炎性因子IL -1、IL -6 及TNF -α 的表達均增加，說明炎癥與hepcidin 的表達在高脂血癥中有著密切聯系。

已有大量研究表明，炎癥在AS 的發生、發展過程中起著重要作用，IL -1、IL -6 及TNF -α 等炎性因子可作為AS 的炎性標志物及風險預測因子，炎性因子可損傷血管內皮，激活機體免疫反應，促進巨噬細胞在內膜下增殖，導致泡沫細胞增加，促進斑塊的形成。炎性因子可誘導hepcidin 的表達，包括IL-1、IL-6 及TNF -α，其中對IL -6 的研究最為深入，其可通過刺激JAK/STAT 信號通路來調控鐵調素的表達［9～11］。故推測hepcidin 表達的升高可能與高脂血癥的炎癥狀態有關，且炎性因子可促進巨噬細胞增殖，使膜鐵轉運蛋白降解而導致鐵沉積增多，從而進一步促進AS。

根據實驗結果可知，川芎嗪組與肝素對照組的hepcidin 的含量均顯著低于模型組(9 周)，同時兩組血清IL-1、IL -6 及TNF -α 表達均降低，但肝素對照組的各項指標下降更為明顯。川芎嗪組血清hepcidin 的含量顯著低于模型組(9 周)，說明其對高表達的hepcidin 具有明顯的抑制作用，這與本課題組前期的細胞實驗結果相一致，從而進一步證實了川芎嗪對hepcidin 高表達的抑制作用，同時川芎嗪組的血清IL-1、IL -6 及TNF -α 表達均降低，而川芎嗪的抗炎作用已通過多個研究證實，故川芎嗪可能通過抑制IL-1、IL -6 及TNF -α 等炎性因子的表達而影響hepcidin 的炎癥相關通路，最終抑制了血清hepcidin的表達［12，13］。通過本研究顯示，川芎嗪與肝素對炎性因子及hepcidin 高表達均有明顯抑制作用，但川芎嗪對炎性因子及hepcidin 高表達的抑制作用尚不及肝素。

本研究結果顯示，高脂血癥可引起hepcidin 的表達升高，川芎嗪與肝素對炎性因子及hepcidin 高表達均有明顯抑制作用，這提示川芎嗪及肝素可能通過其抗炎作用以抑制hepcidin 的高表達，從而進一步發揮其抗動脈粥樣硬化及防治冠心病的作用。然而，體內脂質代謝與hepcidin 表達之間可能存在復雜的聯系，現有研究尚存在爭議，川芎嗪對hepcidin 高表達的抑制作用亦可能存在對其他通路的影響，本課題組將對其機制及不同劑量的川芎嗪對hepcidin 及相關指標的影響進行更深入的研究。

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