油菜品種鎮油6號的指紋圖譜分析

顧炳朝　岳緒國　楊軍　等

摘要：利用單核苷酸多態性標記（SNP）構建鎮油6號等15個油菜品種（系）的指紋圖譜，分析它們之間的遺傳相似性，并通過聚類分析明確它們之間的關系；利用SSR標記分析5個品種的遺傳相似系數，SNP標記與SSR標記的遺傳相似系數間的相關系數為0.82，達顯著水平，表明2種方法所得的指紋圖譜間具有較高的一致性，但SNP標記指紋圖譜所含差異位點信息較多，比SSR標記圖譜更好。

關鍵詞：油菜；品種；指紋圖譜；聚類分析

中圖分類號： S634.301文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0087-03

收稿日期：2014-02-28

基金項目：江蘇省農業科技自主創新資金[編號：CX（11）1026]；江蘇省科技支撐（農業）計劃（編號：BE2013435）。

作者簡介：顧炳朝（1956—），男，江蘇常州人，副研究員，主要從事油菜育種與品種推廣工作。Tel：（0511）87265433；E-mail：gbc0115@163.com。鑒別優良品種的DNA指紋特性，對品種保護具有重要意義。SSR等分子標記技術可鑒定個體或種群基因組之間的特異性DNA片段，通過大量的標記分析可對品種的指紋圖譜作出鑒別[1-4]。為鑒別油菜的指紋圖譜，學者通過十多年研究，制定了油菜指紋圖譜的國家標準（GB/T 19557.1—2004），該標準從眾多的標記中精選出40對引物用以鑒定油菜品種指紋圖譜，具有工作量小、快速有效的特點。油菜品種的鑒定包括形態鑒定、標記鑒定、數量性狀鑒定等多個方面。在SSR指紋圖譜鑒定基礎上，可能會發現某些品種的SSR標記圖譜間沒有或者僅有很小的差異，這并不意味著2個材料就是完全相同的，還需要進一步作種植鑒定[5-9]，若種植鑒定有差別可認為是2個品種。出現這種情況的原因可能是標記區段不能夠覆蓋油菜品種差異區段，或者指紋圖譜不夠精細導致品種基因組差異沒被檢測到。單核苷酸多態性標記（SNP）技術的出現，為指紋圖譜鑒定提供了新方法[10-12]。采用芯片技術的SNP標記分析方法可以提供數量眾多的標記信息，在基因定位和基因功能研究等方面應用廣泛，也是指紋圖譜鑒定的較好方法。油菜SNP芯片含有5.2萬個標記位點，可否用于鑒別油菜的指紋圖譜值得探討。本研究首次采用了SNP標記技術，以油菜新品種鎮油6號等為材料[13-14]，研究這些品種的指紋圖譜，并且為油菜指紋圖譜鑒定提供新方法。

1材料與方法

1.1材料

試驗所用油菜品種8個，分別為鎮油6號、Tapidor、中雙11號、寧油16、史力佳、史力豐、秦優7號和油研817；以及鎮江農業科學研究所育成品系8個，分別為ZJ196、ZJ197、ZJ254、ZJ263、ZJ267、ZJ426、ZJ427和ZJ429。

1.2DNA的提取

供試材料在長至6～8張真葉時取樣，置于-80 ℃冰箱保存備用。SSR標記試驗采用SDS法提取DNA，SNP標記試驗采用CTAB法提取DNA。

1.3SSR標記試驗方法

采用GB/T 19557.1-2004《植物新品種特異性、一致性和穩定性測試指南總則》中使用的40對SSR引物。SSR反應體系采用10 μL體系：1 μL DNA（50 ng/μL），1 μL 10× PCR Buffer，0.2 μL dNTPs（2mM），0.1 μL TaqE（5 U/μL），0.5 μL F-Primer（50 ng/μL），0.5 μL R-Primer（50 ng/μL），6.7 μL ddH2O。PCR擴增程序：94 ℃預變性 5 min；4 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35個循環；最后在72 ℃終延伸10 min，4 ℃冰箱保存。PCR產物在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳，電泳電壓為210 V，時間75 min。固定，滲透，漂洗，顯色，最后拍照和記錄位點。

1.4SNP標記試驗方法

SNP標記試驗采用Infinium芯片技術。供試材料的DNA樣本交北京怡美通德公司完成DNA雜交和芯片檢測，獲得各個品種5.2萬個SNP位點信息，作為指紋圖譜信息。

1.5數據統計方法

各材料的SSR 擴增產物采用二元性編碼，即以1代表有譜帶，以0代表無譜帶，將所得到的0和1數據按順序排列構成品種的指紋圖譜，計算遺傳相似系數。用非加權組平均法（ UPGMA ），采用Nei氏距離作聚類分析，采用NTSYSpc 2.1軟件繪制聚類圖。

各品種的52 157個SNP位點信息，同樣可作為指紋圖譜信息，并且用于計算遺傳相似系數。相似系數使用MATLAB軟件計算，然后用NTSYSpc 2.1軟件作聚類分析。

2結果與分析

2.1SNP標記指紋圖譜

采用SNP芯片技術，檢測了15個品種（系）的SNP標記多態性，并且利用多態性信息，計算了品種的相似系數和Nei氏距離（表1）。結果顯示，ZJ197與ZJ427之間的相似性系數最小，為0.55；ZJ427與ZJ426及ZJ197與秦優7號的遺傳相似性系數最大，為0.74；鎮油6號與寧油16的遺傳相似性系數為0.62；鎮油6號與史力佳的系數為0.70，也比較大。鎮油6號、寧油16號、史力佳都屬于江蘇本省品種，遺傳系數居于中等水平。鎮油6號與中雙11號之間的相似性系數在0.59，與歐洲品種Tapidor的相似系數為0.61，是比較低的，說明遺傳上相距較遠。鎮油6號與本單位育成的8個品系（以ZJ命名）材料間的相似系數在0.58～0.62之間，說明選用材料的遺傳差異較大，這與試驗選材指導思想一致。通過遺傳相似系數可對不同材料作聚類分析（圖1）。從較遠距離的情況看，可歸為2類，一類是ZJ426、ZJ427、ZJ429，其余12份材料可歸為另外一類。聚類圖可明確15個材料的遺傳相似性情況，這為親本選配和材料的遺傳特性評估提供了依據。表115個油菜品種（系）的SNP標記遺傳相似系數

品種（系）

2.2SNP標記與SSR標記指紋圖譜的相關性

按照國家標準的方法，采用40對SSR核心引物對5個遺傳材料的DNA進行PCR擴增，得到DNA特征帶型（圖2）。統計分析5個品種之間的指紋信息差別，得到遺傳相似性系數為0.54～0.76，其中鎮油6號和Tapidor的相似系數最小，為0.54，說明它們遺傳關系遠；而史力豐與史力佳之間的相似性系數最大，為0.76，說明兩者遺傳來源相近（表2）。這些結果與材料的遺傳來源吻合較好。例如，史力豐和史力佳在遺傳上屬于系統系譜的后代，聚類上歸為一類而且相似系數最大（圖3）?？梢钥闯?，油菜SSR指紋圖譜國家標準應用效果還是比較好的。

為研究SNP和SSR標記指紋圖譜的一致性，采用相關性分析方法，計算SSR指紋圖譜的遺傳相似系數與SNP標記指紋圖譜的相似系數間的相關性。結果表明，二者之間的相關系數為0.823 7，達顯著水平，說明二者之間一致性較高，同時

表25個油菜品種的SSR標記遺傳相似系數

品種遺傳相似系數中雙11號Tapidor史力豐史力佳Tapidor0.68史力豐0.580.60史力佳0.620.600.76鎮油6號0.590.540.660.71

也說明2種方法所得的指紋圖譜還是有一定差別的。

3討論

物種的標記包括形態標記、生化標記、SSR標記、SNP標記等多種類型。從標記的豐富程度看，SNP標記的豐富程度最大，SSR標記的豐富程度較好，生化標記和形態標記的豐富程度最小。理論上，標記的豐富程度越高，則分辨品種間差別的能力越強。采用SSR標記開展作物指紋圖譜鑒定從方法學上看是比較好的。SSR標記的多態性位點相對較多，目前油菜指紋圖譜鑒定的國家標準中采用的40對引物基本可以鑒別大多數品種的指紋差異。若品種采用回交等方式育成，可能導致品種間僅有個別區段差別，此時SSR標記因為數量有限，不能夠覆蓋基因組，則有可能難以分辨品種間的指紋差別，因此在指紋鑒定結果出現質疑情況下，還需要進行形態鑒定，以便給出品種鑒定的更加可靠的結論。油菜SNP標記數量多達5萬多個，近似平均覆蓋在全基因組上，可以更好地鑒別品種間的細微差別，可能是品種指紋圖譜鑒定的更好方法。但是用SNP標記鑒定指紋圖譜也有相應不足：（1）SNP標記鑒定的成本較高，若只鑒定單個品種的指紋圖譜，則成本高達2萬元以上，若批量鑒定則成本會有所降低；（2）SNP標記技術依賴芯片技術，在芯片設計時需要根據若干親本差異核苷酸位點設計探針，檢測得到位點信息，那么親本的選擇對指紋圖譜鑒定結果是有一定影響的；（3）SNP標記能夠鑒別2個等位位點的差別，不能鑒別復等位性位點。

作物品種培育過程中，當形態性狀達到一致時，即可認為遺傳材料是穩定的。然而，此時個體間仍然會有一些不易察覺的數量性狀差別，往往這種差別被認為是由環境作用影響的結果，不被重視，這會導致遺傳材料因為環境改變而出現較大的遺傳分離現象。SNP標記理論上可以鑒定純合和雜合位點，那么就應該可以鑒別品種的純合性。然而，對各個品種（系）的雜合位點統計結果表明，各個品種（系）的雜合位點范圍是8.43%～40.76%。試驗品種中無疑包括純合品種，中雙11號屬于純合親本，其雜合位點率最低。純合親本出現雜合位點可能是芯片技術出現數據判讀聚類分析智能性不夠高所造成的。不過，雜合位點百分率作為個體雜合性的參考指標應該是有意義的。研究中發現鎮油6號的雜合位點率比較低，為9.8%，說明該品種的純合性比較好，而一些育種中間世代品系和雜交種的雜合位點百分率比較高。因此，從育種的角度看，利用遺傳材料的SNP標記圖譜可以幫助說明遺傳純合性問題，使純合性判別更加有效。

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