牙鲆彈狀病毒研究進展

張小飛　孫穎杰　賈赟　等

摘要：牙鲆彈狀病毒（Hirame rhabdovirus，HIRRV）可以引起牙鲆、香魚等肌肉組織器官及內臟出血，造血器官壞死，給魚類養殖帶來巨大經濟損失。HIRRV具有囊膜，屬于彈狀病毒科粒外彈狀病毒屬。病毒基因組為單股負鏈的RNA，長約11 000 bp，主要包含5個基因，可編碼核蛋白（nucleoperotein，N）、磷蛋白（phosphoperotein，P）、基質蛋白（matrix preotein，M）、糖蛋白（glycoperotein，G）、依賴RNA的RNA酶（RNA polymerase protein，L）和非結構蛋白（non-virion perotein，NV）。本文就目前國內外關于HIRRV的流行特點、生物學特征、分類地位、基因組及其蛋白產物的特征以及檢測方法等方面進行了較為全面的概述，旨在為該病的預防、控制以及致病機理方面的研究提供依據。

關鍵詞：牙鲆彈狀病毒；基因組；編碼蛋白；檢測方法

中圖分類號： S941.41文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0231-03

收稿日期：2014-03-21

基金項目：國家自然科學基金（編號：41276174）。

作者簡介：張小飛（1990—），女，河南寶豐人，碩士研究生，從事海洋生物疫病研究。Tel：（0411）82583668；E-mail：longlongai3227@163.com。

通信作者：賈赟，高級獸醫師，從事動物傳染病檢測、防制研究。E-mail：jxy750921@163.com。牙鲆彈狀病毒（Hirame rhabdovirus，HIRRV）為單股負鏈RNA病毒，是彈狀病毒科粒外彈狀病毒屬新成員，流行病學上表現為低溫（≤15 ℃）發病，主要感染牙鲆、香魚，感染魚其鰭、肌肉組織及內部器官出血，造血器官壞死；人工感染對黑鯛、無備平鲉和虹鱒等海水魚類或降河洄游魚類具有強烈致病性，給全球海水養殖業造成了嚴重的經濟損失[1-2]。根據《中韓進出口活水生動物檢驗檢疫協議》，進出境的鱸魚、真鯛、牙鲆、大菱鲆、鯉魚、鯽魚等養殖和種苗用魚種，均要進行HIRRV疫病檢測，口岸安全意義重大。國外對HIRRV的研究相對較早，而國內目前研究主要集中在病毒分離、基因組測序和分子診斷方法的建立等方面工作[1-2]，研究內容相對局限。本文就目前國內外關于HIRRV的流行特點、生物學特征、分類地位、基因組及其蛋白產物的特征以及檢測方法等方面進行了較為全面的概述，旨在為該病的預防、控制以及致病機理方面的研究提供依據。

1發現及流行

1986年，首次在日本兵庫縣的患病牙鲆和香魚魚苗中分離得到HIRRV日本株（8401-H）[3]，1987年Sano等在香魚（Plecoglossus altivelis）、黑鯛（Milio macrocephalus）、無備平鲉（Sebastes inermis）中也發現了HIRRV[4]。1997年、2007年又分別在韓國南部海域的牙鲆和中國山東榮成的石鰈幼魚中發病，并經分離得到HIRRV韓國株（CA-9703）和中國株（SR080113）[1，5]。HIRRV主要感染海水魚，但 1992年Oseko等試驗發現HIRRV對部分淡水魚同樣具有致病性[6]，不過在淡水魚養殖方面目前還沒有發現該病毒。直到2012年EURL會議（16th Annual Meeting of the National Reference Laboratories for Fish Diseases）報告指出HIRRV在中國淡水魚養殖中已經廣泛傳播。2013年Borzym等在歐洲的河鱒魚（淡水魚）中分離得到了HIRRV病毒（j.No.207237），經過測序分析發現歐洲株和中國株P基因的同源性達到99%，L和N基因的同源性在99%以上[7]，有學者認為HIRRV歐洲株很可能是通過冷凍食品由中國進入歐洲。

2生物學特征

HIRRV病毒粒子呈彈狀，為彈狀病毒典型的形態學特征，病毒粒子長160～180 nm，寬60～80 nm?；蚪M長度約為11 000 bp[1，5]，主要與核蛋白（N） 結合形成核衣殼，呈螺旋對稱，在核衣殼上還結合有少量的聚合酶（L） 和磷蛋白（P）；囊膜，緊密地包裹著核衣殼，囊膜由脂質和蛋白質組成，其內表面為基質蛋白（M），囊膜上有糖蛋白（G） 突起。成熟的病毒粒子通過細胞膜出芽，釋放到胞膜外。

該病毒能夠在EPC（鯉魚上皮瘤細胞系）、FHM（肥頭鯉細胞系）、CHSE-214（大鱗大馬哈魚胚胎細胞系）、CO（草魚卵巢細胞系）、CIK（草魚腎細胞系）、BF-2（藍鰓魚幼魚細胞系）、R1（虹鱒肝細胞系）、SSN-1（紋鱧細胞系）等魚類細胞上增殖，并出現細胞病變效應（cytopathogenic effect，CPE），其中FHM、EPC、BF-2、CHSE-214最為敏感，最大滴度達到107 TCID50/100 μL；該病毒的最適生長溫度為20 ℃，僅2 d就能病變完全，而且病毒滴度達到109 TCID50/100 μL[8]。該病毒的感染活性可以被pH值（3.0和9.0）、脂溶劑（三氯甲烷）以及熱（56 ℃，30 min）等破壞。

3分類地位

1991年，Nishizawa等發現HIRRV由N、P、M、G、L 等5個結構蛋白構成，其蛋白質電泳圖譜和狂犬病毒屬相似，把HIRRV歸到彈狀病毒科的狂犬病毒屬[9]。直到1997年Kurath等發現G基因和L基因之間存在NV基因[10]；2000年國際病毒學分類委員會（ICTV）第7次報告中，正式把HIRRV列為彈狀病毒科的一個新屬——粒外彈狀病毒屬[11]。粒外彈狀病毒屬病毒在其糖蛋白和聚合酶蛋白之間均存在一個獨特的非結構蛋白，該蛋白存在于受感染的細胞中，但不存在于成熟的病毒粒子中，這也是粒外彈狀病毒區別于水皰病毒的一個主要標志[12]。

4基因組及其蛋白產物的特征

4.1基因組特征

HRV基因組的測序工作起始于P和M基因[13]，目前，HIRRV的全基因組序列已經測定，基因組大小約11 000 bp[1，5，14]，基因組含有6個開放閱讀框（ORFs），分別編碼6種蛋白：核蛋白（nucleoperotein，N）、磷蛋白（phosphopero tein，P）、基質蛋白（matrix preotein，M）、糖蛋白（glycoperotein，G）、依賴RNA的RNA酶（RNA polymerase protein，L）和非結構蛋白（non-virion perotein，NV）（表1） [5]。

表1HIRRV韓國株（CA-9703）基因組中6種基因的特征

基因位置

（bp）上游非翻

譯區（nt）下游非翻

譯區（nt）蛋白長度

（aa）蛋白分子

量（ku）N62～1 4075510539242.5P1 409～2 179443622725.8M2 234～2 815585319321.6G2 882～4 492354250856.6NV4 494～4 87003411112.7L4 872～10 96147751 987225注：蛋白長度和蛋白分子量是有開放閱讀框直接翻譯的推算的蛋白質，沒有經過磷酸化或糖基化的轉錄后修飾。

基因結構是由3′端非翻譯前導（Leader）區、基因區、基因間連接區及5′端非轉錄拖尾（Trailer）區組成。排列方式為3′Leader-N-P（M1）-M（M2）-G-NV（非結構蛋白）-L-Trailer 5′（圖1）[1，5]。HIRRV的前導區含有位于54～60的多聚腺苷酸化信號（UAUCUUUUUUU），而拖尾區中含有L基因轉錄終止和多聚腺苷酸化信號，且基因組3′端和5′端呈反向互補，這是非節段負鏈RNA病毒的共同特征，可能對平衡病毒的轉錄和復制過程其重要作用（圖2）[5，15]。

基因間的連接區內含有高度保守的上游基因和多聚腺苷酸化信號、下游基因轉錄起始信號以及轉錄和起始信號間的間隔序列[16]。HIRRV基因間連接區的保守序列為AGATAG（A）7TGGCAC（N）4GTG[17-18]，其中AGATAG（A）7為轉錄終止和多聚腺苷酸化信號；基因間的間隔序列一般只含有1個核苷酸（U或G）[19]，這些調節信號和基因間區域在HIRRV和其他粒外彈狀病毒屬成員之間都是一致的，但區別于彈狀病毒科的其他屬。

4.2編碼蛋白的特征

N蛋白是病毒粒子中含量最豐富的蛋白，它和病毒RNA緊密結合，形成核糖核蛋白體N-RNA結構，并構成轉錄和復制的模板，在轉錄調節中起著重要的作用。

P蛋白是和聚合酶相關的磷酸化蛋白，它與N蛋白和L蛋白相互作用，在轉錄和復制過程中起著關鍵的作用[20-21]。該蛋白根據序列推算的pI為8.68[18]，而根據等點聚焦推算出來的pI為7.3～7.4[22]，這可能是因為魚類細胞所產生的蛋白磷酸化程度有關。P蛋白以分子伴侶的形式與N蛋白結合，阻止N蛋白自身聚集，從而保證N蛋白以可溶性的分子存在[23-25]，同時也能阻止N蛋白與非特異性的RNA結合[26]。

M蛋白在病毒出芽過程中，核衣殼與G蛋白相互作用，起始病毒的裝配。然后與M蛋白結合形成核衣殼-M蛋白結合物，完成病毒裝配，出芽形成子病毒，進而感染其他細胞[27]。

G蛋白是病毒的主要抗原，能誘導產生中和抗體和刺激細胞免疫，因此通常選擇G基因作為抗原基因來構建DNA疫苗。Yasuike等比較HIRRV G蛋白疫苗和N蛋白疫苗的免疫效果，發現G蛋白疫苗比N蛋白疫苗更能引起一系列的免疫反應[28]，但是G蛋白和N蛋白疫苗的具體免疫機制還不太清楚，有待進一步的研究。

NV蛋白是粒外彈狀病毒屬所特有的非結構蛋白，僅存在于感染細胞中，不存在于成熟的病毒粒子中。Johnson等利用反向遺傳技術構建NV基因突變的重組SHRV病毒，發現重組的SHRV與野生型病毒具有相同的感染力及行態，從而證實了NV基因對SHRV的復制沒有重要影響[29]。Biacchesi等將IHNV病毒NV基因替換成GFP（綠色熒光蛋白）或CAT（氯霉素乙酰轉移酶）基因，病毒的復制不受影響[30]。有學者認為NV基因并不是病毒在細胞的生長過程中所必須的，同時對病毒在體內的致病性也不起重要作用[31]。例如，Chiou等在2000年首次發現NV基因在細胞培養過程中與細胞病變（使細胞變圓）相關[32]。最近也有研究表明IHNV的NV基因對IHNV在細胞中的最佳復制起著關鍵的生物作用，同時與IHNV的致病性有關[33]，但有關NV蛋白的具體作用尚有待進一步深入的研究。

L蛋白病毒最大的結構蛋白，也是病毒RNA依賴的RNA聚合酶，具有多種酶活性，包括核苷酸聚合活性、甲基化轉移酶和鳥苷轉移酶活性、以及多聚腺苷酸轉移酶活性等。

5牙鲆彈狀病毒檢測方法

目前，病毒的檢測方法主要有三大類，分別是細胞學診斷技術、免疫學診斷技術、分子生物學診斷技術，其中細胞學診斷技術主要包括細胞培養分離病毒、組織病理切片及電鏡觀察，其操作復雜、檢測周期長且靈敏度低。免疫學診斷技術主要包括免疫熒光檢測、免疫斑點印跡雜交，其方法具有特異性高、靈敏度強等特點，但是過程也相當復雜，不適宜對大量樣品的檢測。分子生物學方診斷技術主要包括聚合酶鏈式反應（PCR）、實時定量RT-PCR、環介導的恒溫擴增技術（LAMP），利用該技術鑒定病原具有快速、準確、靈敏度高等優點，目前應用較為廣泛，如孫穎杰等根據G蛋白的序列建立了檢測HIRRV的RT-PCR、實時定量-PCR、LAMP方法[34]。

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