新疆棉花黃萎病拮抗放線菌的分離與篩選

來娜娜+朱文豪+劉政+等

摘要：為獲得對新疆地區棉花黃萎病具有拮抗活性的土壤放線菌，從新疆不同地區棉田采集24份健康棉花根際土樣，通過平板稀釋法分離純化得到放線菌561株。經室內平板對峙法篩選獲得101株具有拮抗棉花黃萎病菌作用的放線菌，獲得抑菌圈直徑≥17 mm的放線菌5株，其中TD3-2-1的抑菌圈直徑達20.07 mm，其發酵液對棉花黃萎病菌菌絲抑菌率達79.7%。TD3-2-1具有作為生防菌的潛能。

關鍵詞：棉花黃萎??；放線菌；拮抗作用；分離；生物防治

中圖分類號： S435.621.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0119-02

收稿日期：2014-03-18

基金項目：國家自然科學基金（編號：31360452）。

作者簡介：來娜娜（1987—），女，甘肅蘭州人，碩士研究生，從事植物病害生物防治研究。 E-mail：lainana1234@qq.com。

通信作者：王曉東，博士，副教授，從事植物病害生物防治研究。E-mail：wxd_agr@shzu.edu.cn。新疆是我國最大的商品優質棉生產基地，棉花產業是新疆地區的重要支柱產業。由于棉花種植面積擴大、常年連作、頻繁調引品種和秸稈還田等原因[1-2]，棉花黃萎病的發生日趨嚴重，該病具有寄主廣泛、土壤傳播快、抗逆性強和變異性大等特點[3]，給新疆棉花生產造成極大危害，已成為制約新疆棉花生產可持續發展的主要限制因素[4]。目前，國內外防治棉花黃萎病主要通過培育抗病品種、化學防治、農業措施和植物檢疫等。經生產實踐檢驗的陸地棉抗黃萎病新材料的選育迄今尚未取得重大突破[4-5]，主要原因在于棉花黃萎病菌在全國主產棉區存在著大量不同的生理小種，攜帶黃萎病抗性基因的品種非常少[6]，且抗病性是相對的、暫時的；另外，育種材料中嚴重缺乏廣譜抗黃萎病的類型[7-9]。采用化學防治不僅造成環境污染，而且對防治棉花黃萎病菌及形成的微菌核效果不佳。農業措施中使用較多的是輪作，該方法需要將宿主作物與非宿主植物（如單子葉植物）輪作4～5季才有較好的效果[10]。鑒于此，篩選出病菌高效拮抗菌，人為增施生物菌劑已成為棉花黃萎病綜合防治中最具潛力的防治措施之一[11]。通過對新疆多個棉區棉花根際土壤中微生物的大量分離，以期篩選出對棉花黃萎病菌具有高效拮抗作用的放線菌菌株，為新疆棉花黃萎病生物防治提供科學依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1土樣采集從新疆石河子、庫爾勒、阜康、阿瓦提、昭蘇等地棉田中，用五點取樣法采集土樣24份。采集土樣時，隨機選取健康棉株，距棉株主干5 cm處，用小鏟撥去地表土層，以見棉花根系為宜，取土樣約200 g，裝入保鮮袋內，注明采集日期、地點、土質和土樣編號等，置于室溫下風干備用。

1.1.2供試菌株棉花黃萎病原菌大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）MK-XJ，由石河子大學農學院植物病理教研室王曉東提供。

1.1.3供試培養基高氏一號培養基[12]：可溶性淀粉20 g，KNO3 1 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂18 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值 7.4～7.6。不加瓊脂為高氏一號培養液。121 ℃滅菌26 min后備用。PDA培養基：馬鈴薯 200 g，切成小塊后放入1 000 mL蒸餾水中煮15 min，紗布過濾后加瓊脂18 g、葡萄糖20 g，溶化后補足水分至1 000 mL。121 ℃滅菌26 min后備用。

1.2土壤放線菌的分離純化

采用平板稀釋法進行[1]。稱取土樣10 g，放入90 mL含有玻璃珠的無菌水中（150 mL三角瓶），28 ℃、150 r/min恒溫搖培20 min，靜置15 min后，在無菌條件下吸取土壤懸浮液，用無菌水依次稀釋至10-2、10-3、10-4，然后用移液器吸取100 μL稀釋液均勻涂布在高氏一號培養基平板上，表面晾干后，放入28 ℃恒溫培養箱中培養5 d，挑出形態各異的放線菌菌落，通過平板稀釋劃線法進行純化，所獲菌株進行編號后，保存在4 ℃保鮮柜中備用。

1.3拮抗放線菌的初篩

采用平板對峙法[12]進行拮抗放線菌的初篩。將MK-XJ的孢子菌懸液濃度調至1×107 CFU/mL，無菌條件下吸取 40 μL 均勻涂布在PDA培養基平板上，表面晾干后備用。放線菌培養5 d后用無菌打孔器（打孔直徑5 mm）沿菌落同心環上進行打孔，挑取菌餅放入涂布有MK-XJ孢子的PDA培養基平板上，每皿均勻分布3塊菌餅，放在25 ℃恒溫培養箱中培養7 d后，觀察放線菌抑菌情況，并利用“十”字交叉法測量抑菌圈直徑。

1.4拮抗放線菌的復篩

對初篩中具有拮抗MK-XJ作用的放線菌再次進行篩選。對峙后的培養皿放在25 ℃恒溫培養箱中培養15 d后，進行觀察和測量。具體方法同“1.3”節。

1.5拮抗放線菌發酵液對MK-XJ菌絲生長的影響

1.5.1放線菌發酵液的制備挑取新鮮拮抗放線菌菌絲塊，接種至100 mL高氏一號培養液（250 mL三角瓶）中，180 r/min、28 ℃振蕩培養5 d，取發酵液4 ℃、1×104 r/min離心20 min后，傾出上清液，經膜孔0.45 μm細菌器過濾后，放置在4 ℃冰箱內保存備用。

1.5.2拮抗放線菌發酵液對MK-XJ菌絲生長的影響將生長良好的MK-XJ菌落用無菌打孔器制成菌餅（打孔直徑7 mm），浸泡在稀釋10倍的放線菌發酵液中，處理30 min后，取出晾干。挑取菌餅放入PDA培養基平板中，25 ℃恒溫培養7 d。利用“十”字交叉法測量菌落直徑。以高氏一號培養液為對照，試驗重復3次。計算公式：生長抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-7 mm）×100% 。

1.6數據統計與分析

采用SAS 8.0中的方差分析程序（ANOVA）分析上述各試驗中不同處理間的差異顯著性。抑菌率數據在進行方差分析前進行反正弦轉化。處理之間的差異顯著性采用Duncans新復極差法（P<0.05）。

2結果與分析

2.1土壤放線菌的分離及拮抗菌初步篩選

由表1可知，從新疆不同地區采集的24份土樣中分離得到561株放線菌。從中獲得101株對MK-XJ具有不同程度拮抗作用的放線菌，占分離菌株總數18.0%。抑菌圈直徑 ≥10 mm 的放線菌有59株，占分離菌株總數10.52%；抑菌圈直徑≥15 mm 的放線菌29株，占分離菌株總數5.2%。

表1新疆棉田土壤放線菌分離及拮抗菌的篩選

序

2.2拮抗放線菌的復篩

對初篩獲得的29株具有拮抗MK-XJ作用的放線菌進行二次篩選，結果獲得抑菌圈≥17 mm的拮抗放線菌5株，對這5株放線菌進行第3次篩選，結果（圖1）表明，菌株 TD3-2-1 的抑菌圈直徑為2007 mm，與其他菌株差異顯著。

2.3拮抗放線菌發酵液對MK-XJ菌絲生長的影響

由圖2可知，供試5株拮抗放線菌發酵液對MK-XJ菌絲生長均具有不同程度的抗生作用。其中，放線菌TD3-2-1抑菌率最大，為79.7%，與其他放線菌菌株抑菌率差異顯著。放線菌GS-22發酵處理后的抑菌率為55.7%，LG-22抑菌率為58.5%，兩者間差異不顯著。

3討論

棉花黃萎病是由大麗輪枝菌引起的一種真菌性土傳病害，主要侵染棉株維管束系統，引起棉花大幅度減產。國內外雖已在棉花抗黃萎病育種、農業措施及化學防治等方面做了大量的研究，并取得了一定成果，但仍然未從根本上解決該病的防治問題[13]。在探索新的防治途徑中，利用拮抗性微生物已成為棉花黃萎病最具前景的防治手段之一[14]。近年來，國內外學者針對對棉花黃萎病有防效的拮抗微生物做了大量篩選，其中對生防細菌和真菌研究較多[15-18]，而對拮抗放線菌的研究較少。放線菌是一類土壤和植物根際的重要微生物種群，分布廣泛，抗逆性較強，所生產的抗生素種類繁多、功能各異，這些突出的特征在植物病害生物防治中起著至關重要的作用[19]。劉大群等從土壤中分離獲得了一株拮抗鏈霉菌Men-myco-93-6，研究發現該菌及其次生代謝產物對不同致病力的棉花黃萎病菌均表現較強的抑制作用，且對棉花具有增產效果[20]。本研究從新疆不同棉區土樣中經大量分離和多次篩選，成功獲得一株對棉花黃萎病具有拮抗作用的放線菌菌株TD3-2-1，其發酵液對棉花黃萎病菌生長的抑制率達79.7%，具有良好的生防潛質。拮抗放線菌的篩選進一步拓寬了棉花黃萎病拮抗微生物種類的篩選范圍，可為今后棉花黃萎病的生防工作提供參考。放線菌TD3-2-1對棉花黃萎病的生防機理有待進一步研究。

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