黃綠木霉菌發酵液對水稻防御酶的影響

林志偉+孫冬梅+遲麗

摘要：以黃綠木霉菌在馬鈴薯幾丁質營養液中培養96 h獲得的發酵濾液為試驗藥劑，進行室內稻瘟病菌孢懸液人工接種與防治處理，測定水稻植株各防御性關鍵酶的變化規律，研究黃綠木霉菌發酵液對水稻植株抗病性的誘導能力。結果表明，噴施發酵液的水稻植株，稻瘟病病斑比對照減??；不同處理間水稻植株酶活性變化不同，噴施發酵液并接種病菌的水稻植株各種防御酶活性峰值出現較早，接種12 h，多酚氧化酶（PPO） 含量是對照的4倍，苯丙氨酸解氨酶（PAL）含量比對照高25%，綠原酸含量比對照高60%；接種48 h，過氧化物酶（POD）含量是對照的8倍。黃綠木霉菌幾丁質發酵液具有抗御稻瘟病菌侵染和提高防御酶活性的作用。

關鍵詞：黃綠木霉菌；幾丁質；稻瘟??；防御酶；多酚氧化酶；苯丙氨酸解氨酶；過氧化物酶

中圖分類號： S435.11文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0121-03

收稿日期：2014-03-31

基金項目：黑龍江省齊齊哈爾市科技計劃（編號：NYGG2010-09）。

作者簡介：林志偉（1970—），男，黑龍江勃利人，碩士，副教授，主要從事植物病蟲害綜合防治技術研究。Tel：（0459）6819182；E-mail：lzwsdm@sohu.com。幾丁寡糖為功能型低聚糖，水溶性好且易被分散吸收，具有多種生理和生物學功能，尤其是可提高植物對病原菌的抵抗能力，啟動和激發植物的防御系統[1]，目前已被廣泛應用到農業生產領域[2]。幾丁寡糖可由幾丁質通過酸解法、氧化法和酶解法降解產生[3]。傳統化學方法降解幾丁質的反應條件難以控制，反應穩定性和重復性較差，易造成環境污染。利用生物發酵技術降解幾丁質成為當前研究熱點，至今，已發現包括細菌、真菌和植物[4]在內的許多生物能產生幾丁質降解酶。黃綠木霉菌（Trichodema aureoviride）對幾丁質有較好的降解能力[5]，對水稻紋枯病菌[Thanatephorus cucumeris （Frank） Donk]、稻瘟病菌（Pyricularia grisea）、核盤菌[Sclerotinia sclerotiorum （Lib.） de Bary]等有良好的應用潛能[6-8]。有研究表明，微生物代謝產生的幾丁寡糖可以誘導植物提高抗病能力[9-12]，但有關黃綠木霉菌代謝產物誘導抗病能力的產生還未見報道。研究黃綠木霉菌在含幾丁質營養液中發酵所得濾液對水稻植株防御酶系的影響，探索黃綠木霉發酵幾丁質產生幾丁寡糖的利用途徑，明確黃綠木霉菌防病作用機理，對開拓植物病害的生物防治資源具有重要意義。

1材料與方法

1.1供試材料

供試菌種黃綠木霉菌T4、水稻稻瘟病菌ZD1，由黑龍江八一農墾大學植物保護系提供；試驗水稻品種為墾鑒稻5號，由黑龍江八一農墾大學農學院水稻中心提供。改良馬鈴薯幾丁質發酵培養液為：馬鈴薯200 g、葡萄糖5 g、K2HPO4 0.7 g、KH2PO4 0.3 g、KCl 0.01 g、FeSO4 0.01 g、MgSO4 0.5 g、膠態幾丁質8 g，用蒸餾水定容至1 000 mL，分裝于500 mL三角瓶中。

1.2試驗方法

1.2.1黃綠木霉菌的發酵培養及發酵濾液獲得將孢子濃度為2.5×107個/mL的黃綠木霉菌孢懸液，接種于改良馬鈴薯幾丁質培養液中，28 ℃、120 r/min恒溫振蕩培養4 d；過濾除去菌體，即得木霉菌幾丁質發酵濾液。

1.2.2水稻植株栽培與處理方法將墾鑒稻5號秧苗插栽于直徑25 cm、高20 cm的花盆中，按三角位置每盆插栽3穴，1株/穴；每日觀察花盆內水量，適當補水，保證水稻正常生長至孕穗期；在水稻孕穗期進行噴霧接種。試驗設噴施發酵濾液不接種稻瘟病菌孢子懸液、噴施清水并接種稻瘟病菌孢子懸液、噴施發酵濾液2 h后接種稻瘟病菌孢子懸液、噴施清水不接種稻瘟病菌孢子懸液為空白對照共4個處理，接種稻瘟病菌孢子懸液濃度為1.6×108個/mL，于16：00—17：00，使用手執式噴霧器在水稻植株上方均勻噴霧；分別將每盆水稻用有機玻璃罩保濕36 h，除去有機罩，每日觀察水稻葉片病斑出現情況；處理結束后12、24、48、72、96、122、144 h，剪取水稻最上部2張葉片，立即用天平稱質量，并按文獻[13]方法測定水稻葉片過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）及綠原酸等指標。

2結果與分析

2.1黃綠木霉菌幾丁質發酵濾液對水稻稻瘟病的控制作用

試驗結果表明，在水稻植株接種稻瘟病菌并保濕，各水稻植株葉片上均有稻瘟病病斑出現，病斑出現的時間和病斑數量沒有差別，病斑均為典型的稻瘟病急性病斑，病斑較??；噴施發酵濾液的植株，稻瘟病病斑周圍的黃色暈圈不明顯，而只接種病原菌的水稻葉片，病斑周圍有明顯的黃色暈圈，病斑向兩端延伸明顯（表1）。經發酵濾液處理的水稻葉片發病程度減輕，一定程度上抑制了病原菌生長，限制了病原菌對水稻葉片的危害。表1噴施黃綠木霉菌幾丁質發酵液對稻瘟病斑的影響

處理病斑長直徑

（mm）病斑短直徑

（mm）黃暈寬度

（mm）噴施清水并接種稻瘟病孢子懸液3.62a0.84a0.45a噴施發酵液2 h后接種稻瘟病孢子懸液1.12b0.65a0.12b

2.2黃綠木霉菌幾丁質發酵濾液對水稻抗病關鍵酶活性的影響

2.2.1過氧化物酶的活性變化植物體內過氧化物酶活性與植物抗病性呈正相關[14]。試驗結果表明，未噴施發酵濾液而接種稻瘟病菌的水稻新葉，POD酶在接種12～72 h內與對照在同一水平范圍波動，72 h后發生變化，96 h時POD酶活性大幅躍升，并在96～144 h維持一個較高水平；噴施發酵濾液后接種病菌的水稻植株，葉片POD酶活性在12～48 h內提高幅度很大，24 h時POD酶活性是對照的近7倍，48 h達到近8倍水平，48 h后開始下降，但葉片酶活水平仍略高于對照（圖1）。這是由于病原菌侵染水稻植株葉片后，水稻植株對病原菌產生了抗逆反應[15]，施用發酵濾液，在一定程度上使葉片POD酶活性提高且抗逆反應提前，有利于保護植物免受病原菌進一步侵染[16]。

2.2.2多酚氧化酶的活性變化PPO是一類廣泛分布于植物體內能催化多酚類氧化成醌類的質體金屬酶，其活性提高有助于提高植物的抗病性[17-18]，對病原菌侵染起到一定限制作用。試驗結果表明，僅接種稻瘟病病菌的水稻葉片，12 h時PPO酶活性幾乎為0，48 h達到最高值，后逐漸下降；清水對照組，水稻葉片PPO酶活性在12～144 h較低，而僅噴施濾液的葉片，PPO酶活性在12 h有顯著提高，并持續至72 h，72～144 h 后稍有下降，但仍高于清水對照組（圖2），這說明噴施濾液可提高植物的抗病性。

2.2.3苯丙氨酸解氨酶的活性變化PAL是植保素、木質素和酚類化合物合成的關鍵酶，與系統獲得抗性表現存在相關性。試驗結果表明，不同處理水稻葉片，在PAL酶活達到高峰后均呈逐漸下降趨勢；PAL初期變化趨勢與PPO相似，12 h時，各處理水稻葉片PAL表現出明顯差異，僅噴施濾液和噴施濾液2 h后接種的水稻葉片，其PAL酶活性比清水對照和只接種病菌分別高25%和10%；僅接種病菌的水稻葉片，其PAL活性在接種120 h后有所升高（圖3）。這進一步表明，噴施濾液對植株抗病性的提高有促進作用。

2.2.4綠原酸的活性變化綠原酸能夠清除自由基，具有抑制IAA氧化酶對植物生長素的破壞[19]，在植物抗病方面起著

特殊作用。由圖4可見，僅噴施發酵濾液，12 h時葉片綠原酸含量顯著高于清水對照，高出60%以上；只接種稻瘟病菌的水稻葉片，綠原酸含量在144 h達到最高值，此時，僅噴施發酵濾液的葉片，其綠原酸含量與清水對照相近。

3結論

過氧化物酶是植物體內普遍存在且活性較高的一種酶，是植物體內的保護酶之一，可以清除細胞內的H2O2，與植物呼吸作用、光合作用、生長素氧化及木質素形成等有關，其活性可以反映某一時期植物體內的代謝及抗逆性變化[14]。苯丙氨酸解氨酶是植物體內苯丙烷代謝途徑的關鍵酶，其活性高低控制著植物體內多種次生酚類化合物、類黃酮植保素、木質素等抗菌物質的合成，在植物次生代謝和抗病代謝中具有重要的作用[20-21]。多酚氧化酶是一類廣泛存在于植物體內的含銅金屬酶類，與作物的褐化有關，可以提高植物對病原菌的抗性[22-23]。本研究結果表明，當水稻葉片受稻瘟病菌協迫后，黃綠木霉菌幾丁質發酵濾液能夠誘導激活水稻葉片內PAL、PPO、POD等幾種抗病關鍵酶的活性，使酶活力有所提高，且葉片內綠原酸含量也得到顯著提高。黃綠木霉菌幾丁質發酵濾液對稻瘟病具有一定的防治作用。

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