抗FOC4香蕉內生放線菌的篩選及菌株NJQG—3A1鑒定

胡一鳳+井濤+王夢穎+等

摘要：以海南臨高和皇桐2地采集的3個品種（系）健康和已感染枯萎病的香蕉植株為樣品，采用組織勻漿法進行內生放線菌的分離，共獲得內生放線菌142株，并以尖孢鐮刀菌4號生理小種為靶標菌株，通過平板對峙試驗，篩選出6株抗性菌株，其中分離得到的NJQG-3A1菌株對尖孢鐮刀菌菌絲生長抑制作用最強，抑制率可達83.21%。對菌株NJQG-3A1進行形態與生理生化特征、16S rRNA基因序列測定及系統發育樹比對分析，結果表明，菌株NJQG-3A1為Streptomyces phaeoluteichromatogennes，其發酵液對溫室盆栽香蕉枯萎病的相對防效可達82.46%，具有良好的開發應用前景。

關鍵詞：香蕉枯萎??；內生放線菌；分離鑒定；拮抗；菌株NJQG-3A1

中圖分類號： S436.68+1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0127-05

收稿日期：2013-12-10

基金項目：現代農業產業技術體系專項（編號：CARS-32）。

作者簡介：胡一鳳（1984—），女，碩士，從事香蕉枯萎病防控研究。E-mail：sunmoonfeng@126.com。

通信作者：黃綿佳，教授，從事植物生理研究，E-mail：hmj886@163.com；張錫炎，研究員，從事香蕉枯萎病防治研究，E-mail：zxyan1981@163.com。香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium oxysporum f. sp. cubense，FOC ）侵染維管束而引起壞死的一種毀滅性真菌性病害，近年來我國香蕉產業深受其害，華南地區尤其嚴重[1-2]。目前，生產上還未見對香蕉枯萎病有效的化學藥劑[3-4]，且農藥殘留還會帶來一系列環境污染問題[5-6]，運用生物防治方法對香蕉枯萎病進行綜合防控已成為國內外的研究熱點[7]。放線菌在病害防治、促進作物生長、提高作物產量等方面起到重要作用，正在被人們越來越多地開發和應用[8-9]。國內外已經報道多種香蕉枯萎病的拮抗微生物，但這些微生物大部分都是從植株體外的環境中分離篩選得到的[10-11]，在香蕉體內定殖能力較弱，嚴重影響防控效果[12]。從植物內生菌中篩選生防菌，可以防治植物病害、克服定殖障礙，使生物防治保持長期的效果[13]。本研究以尖孢鐮刀菌4號生理小種（FOC4）為靶標菌，對香蕉植株進行放線菌分離篩選，并通過盆栽試驗檢測拮抗菌株對香蕉枯萎病的防控效果，以期篩選出對防控香蕉枯萎病具有應用前景的內生放線菌。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病原菌尖孢鐮刀菌4號生理小種，由中國熱帶農業科學院生物技術研究所曾會才實驗室提供。1.1.2主要培養基內生放線菌分離培養基采用改良高氏（Gauses）1號培養基（GS）、1/10 ATCC 合成培養基、葡萄糖天門冬酸培養基（GA）、腐殖酸培養基（HV）、改良高氏2號培養基（GPT）和改良淀粉酪素培養基（SIM）[14-18]，為抑制雜菌生長，在各分離培養基中均加入終濃度為75 mg/L的重鉻酸鉀、100 mg/L的制霉菌素和20 mg/L的萘啶酮酸[18]；放線菌純化培養保存采用YE培養基[15]；抑菌試驗采用馬鈴薯瓊脂培養基（PDA）；液體發酵采用淀粉-大豆粉液體培養基[17]；形態特征觀察采用國際鏈霉菌計劃（ISP）推薦的培養基，參考Shirling等的方法[19-20 ]進行配制。

1.1.3樣品采集與處理2012年11月3日從海南省臨高南寶蕉園（ 19°47′1″N， 109°51′17″E）和皇桐蕉園（ 19°49′58″N， 109°50″E）采集香蕉植株樣品（表1）。每個品種隨機采集香蕉植株10株，混勻。

表1樣品采集信息

采集地點根部土壤

pH值香蕉植株采集植株部位皇桐美臺蕉園4.35農科健康植株（NK）根、球莖、假莖、葉臨高南寶蕉園4.17南天健康植株（NJ）根、球莖、假莖、葉臨高南寶蕉園5.54南天感病植株（NB）根、球莖、假莖、葉臨高南寶蕉園4.17巴西健康植株（BJ）根、球莖、假莖、葉臨高南寶蕉園5.54巴西感病植株（BB）根、球莖、假莖、葉

1.2方法

1.2.1內生放線菌的分離參考阮繼生分離弗蘭克氏菌的方法[21]對樣品進行表面消毒，采用組織塊勻漿法[22]進行內生放線菌分離。

1.2.2香蕉枯萎病內生拮抗放線菌篩選以尖孢鐮刀菌4號生理小種（FOC4）為靶標菌，采用平板對峙法進行初篩；對初篩有活性的菌株用平板對峙法進行復篩，計算抑菌率，公式為：抑菌率=[（對照組菌落半徑-處理組菌落半徑）/對照組菌落半徑]×100%。采用SPSS 20.0進行單因素方差分析和Duncans多重比較。

1.2.3拮抗菌株發酵液對FOC4的抑菌活性拮抗菌株接種于大豆粉液體發酵培養基，28 ℃、200 r/min振蕩培養7 d；取發酵液50 mL，離心，用微孔濾膜過濾上清液除菌；采用含藥介質法，將1 mL活性菌株濾液與9 mL熔融態的PDA培養基混合均勻倒平板；冷卻，接種直徑為6 mm的 FOC4靶標菌于平板中央。以等量大豆粉液體發酵培養基直接發酵培養的上清液倒平板、接種FOC4靶標菌為對照。每處理重復3次，28 ℃倒置培養5 d，計算抑菌率。

以無菌水沖洗、收集FOC4孢子，并稀釋成濃度為1×106 CFU/mL的孢子懸浮液；把活性菌株發酵濾液與FOC4孢子懸浮液等體積混合均勻，置于無菌濾紙片保濕的凹玻片內，28 ℃、相對濕度80%的人工氣候箱中光照培養24 h；取出玻片，以孢子萌發的芽管長度達到或超過孢子半徑定為萌發[23]，在顯微鏡下觀察孢子萌發情況，計算各處理孢子萌發抑制率，公式為：孢子萌發抑制率=[（對照孢子萌發率-處理孢子萌發率）/對照孢子萌發率]×100%。以大豆粉液體培養基為對照，每處理重復3次。

1.2.4拮抗菌株對香蕉枯萎病的防效采用盆栽試驗，共設3個處理：處理1：不接種FOC4病原菌和NJQG-3A1拮抗菌，使用等量的清水；處理2：接種FOC4病原菌，不接種 NJQG-3A1 拮抗菌；處理3：接種FOC4病原菌和NJQG-3A1拮抗菌株。接種用的病原菌27 ℃、120 g/min PDA培養液上搖瓶培養6 d，勻漿，稀釋成106 CFU/mL量級的病原菌孢子懸浮液；除去香蕉杯苗根部的營養土，處理2和處理3傷根，浸泡在病原菌孢子懸浮液中30 min；蕉苗移栽到盆中，處理3用拮抗菌發酵液進行灌根處理，處理1、處理2灌入等量清水，每次澆灌200 mL，每隔7 d 澆灌1次，共計7次；香蕉杯苗移栽后48 d，觀察記錄香蕉植株葉片及根莖部枯萎病發病情況，病情分級標準參照方中達等的方法[24]，進行病情指數統計。在整個盆栽期間，各處理其他管理措施一致。

1.2.5活性菌株鑒定形態特征觀察采用平板插片法[14]。將菌株接種在改良高氏1 號固體培養基上做插片，掃描電鏡觀察其形態特征；培養特征觀察參照《放線菌的分類和鑒定》和《鏈霉菌鑒定手冊》的方法[23，25]；生理生化特征參照 Shirling 等的方法[19-20]進行鑒定。

采用16S rRNA基因序列分析活性菌株。用溶液型細菌基因組DNA提取試劑盒法提取活性菌株基因組DNA，試劑盒購買于北京百泰克生物技術有限公司。根據放線菌的16S rRNA基因的結構特點和保守區，采用通用引物進行16S rRNA基因擴增，通用引物27F、1492R購于上海生物工程公司，擴增片段長度約1 400 bp，正向引物27F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，反向引物1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。反應體系為25 μL：模板1 μL、引物1492R 1 μL、引物27F 1 μL、PCR Mix 12 μL、ddH2O 10 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35個循環；72 ℃終延伸 10 min，4 ℃保存。PCR產物送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序，序列通過EzTaxon 在線比對服務（http：//www. eztaxon.org/）進行相關有效種的相似性搜索，下載相似性較高的放線菌16S rRNA基因序列用Clustal X 1.8軟件進行序列比對，用Mega 6.0軟件構建系統發育樹。

2結果與分析

2.1內生放線菌的分離

將印跡平板于28 ℃下培養14 d，觀察到無菌生長，證實從香蕉樣品中共分離得到的142株代表菌株均為內生放線菌。由圖1可見，在抗病品種南天健康植株中分離得到的內生放線菌最多，共計51株，其次是巴西健康植株，為49株，最少是巴西感病植株，為7株；不同品種香蕉植株內生放線菌分離呈現南天健康植株（NJ）>巴西健康植株（BJ）>農科健康植株（NK）>南天感病植株（NB）>巴西感病植株（BB）的規律，健康株內生放線菌遠遠多于感病植株。

由圖2可見，各組織中內生放線菌分離數量，呈現根>球莖>假莖>葉的規律；根分離的內生放線菌最多，為68株，其次是球莖，為58株，葉中最少，僅6株；香蕉植株根與球莖共分離126株內生放線菌，假莖與葉共分離16株，地下部位組織分離內生放線菌的菌株數大于地上部組織。由圖3可見，巴西健康植株各組織均有內生放線菌的分布，而巴西感病植株體內內生放線菌分布比較單一。

由圖4可見，腐殖酸培養基分離的內生放線菌最多，為62株；改良高氏2號培養基分離的內生放線菌最少，為4株；6種選擇培養基分離內生放線菌菌株數量由多到少的次序為：腐殖酸培養基（HV）﹥葡萄糖天門冬酸培養基（GA）﹥改良高氏1號培養基（GS）﹥改良高氏2號培養基（GPT）﹥1/10 ATCC合成培養基﹥改良淀粉酪素培養基（SIM）。

2.2內生拮抗放線菌的篩選

以FOC4為檢測菌，經初篩和復篩，共篩選出6株拮抗效果較好的放線菌，占分離株數的4.23%，其中，菌株 NJQG-3A1 活性最強，對FOC4抑菌率可達83.21%（表2）。

2.3活性菌株NJQG-3A1發酵液對FOC4的抑菌效果

經含藥介質法檢測，結果顯示，菌株NJQG-3A1發酵液

表2復篩菌株對FOC4的抑菌效果

菌株菌落半徑

（cm）抑菌率

（%）NJQG-3A10.47±0.03383.21ABJQG-A31.00±0.11564.29BBJQG-1211.13±0.03359.64BNJGg-A41.23±0.06756.07BCBJQG-12 1.13±0.03359.64BNBGH-F1.63±0.18641.79CCK2.80±0.1000 D注：同列數據后不同大寫字母表示數據間有極顯著性差異（P<0.01）。

對FOC4菌絲生長的抑制率為90.74%（圖5）。由圖6可見，對照組的FOC4孢子完全萌發，NJQG-3A1發酵液對FOC4孢子萌發的抑制率達到100%。

2.4活性菌株NJQG-3A1對香蕉枯萎病的防控效果

由表3可見，接種病原菌和NJQG-3A1發酵液（處理3）的香蕉植株，其病情指數為15.00，對香蕉枯萎病相對防效為82.46%，菌株NJQG-3A1對香蕉枯萎病具有良好的防控作用，與僅接種病原菌（處理2）相比，差異極為顯著。

表3菌株NJQG-3A1對香蕉枯萎病病盆栽防治效果

不同處理發病率

（%）病情指數相對防效

（%）處理1（清水）5.005.0094.15處理2（病原菌）100.0085.500處理3（病原菌+發酵液）15.0015.0082.46

2.5活性菌株NJQG-3A1的鑒定結果

從形態特征上看，菌株NJQG-3A1在高氏培養基上生長緩慢，菌落呈圓餅粉狀，氣生菌絲為白色，基內菌絲不發達，白色細絲狀。電鏡下掃描可以看到，緊密排列的孢子絲有較少分叉，孢子鏈螺旋狀排列，單個成熟的孢子呈棒桿狀，表面微絨（圖7）。

由表4可見，菌株NJQG-3A1在7種鑒定培養基上均能生長；在酵母膏麥芽汁瓊脂、燕麥片瓊脂、胨酵母膏鐵瓊脂培養基上較其他培養基上生長快，產孢多，且有可溶性色素產生；在甘油天門冬酰胺瓊脂培養基上無基內菌絲；在不同培養基上，基內菌絲呈現出白色、黃褐色、棕色等，氣生菌絲主要為白色至棕色、黃褐色等。

生理生化特征分析結果表明，菌株NJQG-3A1明膠液化，不產黑色素，淀粉水解，不產H2S；在吲哚試驗、脲酶試驗、脂酶試驗與硝酸還原試驗中均顯陽性；可以利用的碳源有核糖、可溶性淀粉、水楊苷、葡萄糖、蔗糖、肌醇等，可以利用的氮源有纈氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、精氨酸、組氨酸、絲氨酸等；最適生長pH值為7.0～8.0，最適生長溫度28～30 ℃；NaCl受耐性為3%。表4菌株NJQG-3A1在不同培養基上的生長特征

培養基生長情況氣生菌絲基內菌絲可溶性色素高氏1號培養基生長慢，產孢少適中、白色白色無酵母膏麥芽汁瓊脂生長快，產孢多豐富、白色至灰棕色黃褐色黃褐色無機鹽淀粉瓊脂生長慢，產孢少適中、白色至棕褐色棕色無燕麥片瓊脂生長快，產孢多豐富，白色至灰棕色黃褐色淡黃色甘油天門冬酰胺瓊脂生長慢，產孢少少，黃棕色無無胨酵母膏鐵瓊脂生長快，產孢多豐富，灰白色至黃褐色黃褐色黃褐色酪氨酸瓊脂生長慢，產孢少少，白色至黃褐色灰白色無

以菌株NJQG-3A1基因組DNA為模板進行PCR擴增，測得菌株NJQG-3A1 16S rRNA基因核苷酸序列長度為 1 421 bp，序列提交GenBank，獲得登錄號為KF703553，在EzTaxon數據庫中經有效種的序列相似性搜索，發現與菌株NJQG-3A1相似性較高的都是鏈霉菌屬成員，其中，與Streptomyces phaeoluteichromatogenes NRRL 5799T相似性最高，達到99.221%。采用BioEdit、Mega 6.0等軟件對菌株進行系統發育分析，并用鄰接法（Neighbour-Joining，NJ法）構建系統發育樹（圖8）。綜合菌株NJQG-3A1的培養特征和生理生化特征，將其鑒定為Streptomyces phaeoluteichromatogenne。

3結論與討論

本研究在6種分離培養基上，采用組織勻漿法從5種香蕉植株體內共分離到142株內生放線菌，經平板對峙試驗，篩選出6株對FOC4具有抑制作用的活性菌株，其中，活性菌株NJQG-3A1對FOC4的抑制作用最強，抑菌率達83.21%，盆栽防效達82.46%。

從植物組織內分離到的內生菌數量和種類受很多因素的影響，如分離材料的來源、分離的組織部位、分離方法、分離培養基的成分、表面消毒程度及培養條件等，目前還沒有一種完全適用的方法可以分離植物組織內的所有微生物，通過選擇適宜的分離方法，可以盡可能多地獲得內生菌。研究結果表明：（1）香蕉植株各個組織中都存在大量的內生放線菌，內生放線菌數量在香蕉組織內呈現根>球莖>假莖>葉的趨勢，這與曹理想等的結果[26]相同。這一方面是由于內生微生物主要是通過根進入植株體內[27]，從而在根部分離得到的內生放線菌相對較多；另一方面可能是在植物內生菌分離的實際操作中，次氯酸鈉、乙醇等常用消毒劑對內生菌有很大的殺傷作用[28]，且消毒時間和消毒方式也會影響分離結果[26]，香蕉葉片組織表皮較薄，消毒時間過長，一部分內生菌可能會被殺死，從而導致在葉中分離到的內生放線菌數量少。（2）從健康植株分離得到的內生放線菌遠遠多于病株，這與林時遲等的研究結論[29]相符，植物體內微生物種群越豐富，數量越多，植物生態系的功能與結構越穩定，越不易感病。（3）從南寶蕉園南天植株內分離得到63株內生放線菌，而從黃桐美臺蕉園農科植株體內分離到23株，這可能是受土壤環境差異影響，南寶蕉園土壤的pH值明顯高于黃桐美臺蕉園，土壤相對偏堿性，堿性條件適合于放線菌的生存[30]。（4）HV和GA培養基上分離得到的內生放線菌數量分別為62株和40株，遠遠大于從GS、SIM、1/10ATCC、GPT培養基上得到的內生放線菌數量，這說明前2種培養基比較適合香蕉內生放線菌的分離。（5）通過平板對峙、含藥介質法及孢子萌發試驗，發現活性菌株NJQG-3A1對FOC4具有明顯的抑制作用，為香蕉內生放線菌抗菌活性物質的開發利用提供了一定的理論與應用基礎。

本試驗由于受到分離手段的局限性，有些內生菌不能在人工培養基上生長，有些內生菌因為生長緩慢而被生長相對較快的菌株所掩蓋，沒有獲得稀有的放線菌，在一定程度上減少了活性菌株的發現概率。此外，本研究主要在室內離體條件下進行，若要更準確地探究拮抗菌株NJQG-3A1的生防潛能，需要對該菌株抑菌活性進行更深層次的綜合評價。

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