五味子果實生長發育及化學成分動態變化研究

安開龍　李德坤　周大錚　等

摘要：以遼寧省產五味子為研究對象，在7—9月果實發育期采樣，測定不同生長階段果實的外觀性狀及主要化學成分變化，用主成分分析方法對不同生長期的五味子品質進行綜合評價，并結合產地實際情況確定五味子適宜采收期。結果表明，在整個生長過程中，不同化學成變化趨勢不同；木脂素成分在一定時間內呈現先升高后降低的趨勢，整體呈現倒“V”形分布，其中8月上旬果實中木脂素成分含量最高；遼寧省產地的五味子適宜采收期在9月上旬。

關鍵詞：五味子；化學成分；動態變化；主成分分析；采收期

中圖分類號：S567.01 文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0234-05

收稿日期：2014-03-26

基金項目：國家科技重大專項（編號：2013ZX09402202）。

作者簡介：安開龍（1988—），男，甘肅武威人，碩士，主要從事中藥材質量控制研究。E-mail：2011104185@njau.edu.cn。

通信作者：郭巧生，博士，教授，主要從事藥用植物資源開發研究。E-mail：gqs@njau.edu.cn。五味子[Schisandra chinensis （ Turcz.） Baill.] 為五味子屬多年生左旋落葉木質藤本植物，是我國溫帶針葉闊葉混交林帶區域和暖溫帶落葉闊葉林區域經歷第四紀冰川時期而保留下來的第三紀古老植物種之一[1]，主要分布于中國東北和華北、朝鮮半島、日本及俄羅斯遠東等地區，其干燥成熟果實作藥用已有2 000多年的歷史。目前，北五味子被廣泛用于制藥、造酒、飲料生產業中，是具有重要經濟價值的藥用植物，開發利用前景極為廣闊。我國五味子主要分布于黑龍江、吉林、遼寧、內蒙古、河北、山東、山西、寧夏、甘肅9?。▍^）[2]。

近年來，關于菘藍、菊花、山茱萸、中華苦荬菜等生長發育和次生代謝合成積累、成分積累動態研究已有報道，對指導藥材采收、科學種植及資源合理利用具有一定意義。但是，有關五味子果實的生長發育及次生代謝物合成積累動態研究未見有文獻報道。因此，本試驗通過對五味子果實期間外觀發育和主要化學成分含量的動態變化進行研究，明確五味子果實期間主要化學成分的變化動態，以期為提高產地藥材產品品質提供科學依據，為北五味子藥材質量標準的建立、控制及合理開發利用提供理論參考。

1材料與方法

1.1材料

材料采自遼寧省新賓縣，經南京農業大學中藥材研究所郭巧生教授鑒定為五味子。在五味子開花坐果到果實成熟整個發育過程中共取樣6次。在首次采樣時，隨機選擇生長狀況良好、長勢一致、無病害植株做好標記；后續采樣時，從標記植株上隨機剪取無病蟲害果穗放入低溫樣品箱，盡快帶回實驗室；將樣品混勻，洗凈、擦干，隨機選取測定。

1.2儀器與試劑

Waters alliance 2695 型高效液相色譜單元、Waters 2489 型紫外/可見光檢測器、Empower 2 工作站，美國Waters公司生產；XS 105型電子分析天平、AL 204 型電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司生產；KQ-5200型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司生產；WK 1000A高速粉碎機，山東省青州市精誠醫藥裝備有限公司生產；DGG 101-1BS電熱鼓風干燥箱，天津市天宇實驗儀器有限公司生產；Milli-Q A10超純水系統，美國Millipore公司生產；pH計、磁力攪拌機、游標卡尺、常規玻璃儀器等，國產。

五味子醇甲（批號：110857-200709，純度≥99%）、五味子酯甲（批號：111529-200503，純度≥99%）、五味子甲素（批號110764-200609，純度≥98%）、五味子乙素（批號110765-200710，純度≥99%）對照品，購自中國食品藥品檢定研究院；五味子醇乙、五味子丙素、5-羥甲基糠醛（5-HMF）對照品，純度≥98%，購自天津馬克生物技術有限公司；戈米辛D、戈米辛G、戈米辛J，純度≥98%，購自天津一方科技有限公司；當歸酰戈米辛H、當歸酰戈米辛Q，純度≥98%，自制。分析純維生素C，國產；L-蘋果酸、檸檬酸對照品，美國Supelco公司；莽草酸對照品，純度大于98.8%，批號：14800，上海晶純試劑有限公司；分析純磷酸二氫鉀、草酸，天津市風船試劑科技有限公司；色譜純磷酸，天津市光復精細化工研究所；硫酸（優級純），國產；蒽酮，國藥集團化學試劑有限公司；色譜純乙腈、甲醇，純度≥99.9%，德國Merck集團。

1.3試驗方法

1.3.1五味子果實生長發育分別隨機抽取50個五味子鮮果果實和50粒種子。以游標卡尺測定鮮果和種子的最寬處（橫徑）與最長處（縱徑）尺寸；采用量筒排水法，以加入果實或種子前后的水位差分別作為鮮果和種子的體積；以電子天平測定鮮果果實和種子的質量（鮮質量）及果實和種子烘至恒重時的質量（干質量）。

1.3.2木脂素類成分測定采用液相色譜儀進行測定，色譜條件[3]為：Waters alliance 2695 型高效液相色譜單元，Waters 2489 型紫外/可見光檢測器，Empower 2工作站，Waters Symmetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水，梯度洗脫；柱溫為30 ℃，檢測波長為218 nm，流速為 1 mL/min，進樣量為10 μL。結果如圖1所示。

1.3.3酸類成分測定維生素C、L-蘋果酸、莽草酸、檸檬酸含量測定采用液相色譜儀。維生素C含量測定的色譜條件：PrevailTM Organic Acid色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為01%草酸，等度洗脫；流速為1 mL/min，檢測波長為244 nm，柱溫為30 ℃。結果如圖2所示。L-蘋果酸、莽草酸、檸檬酸含量測定的色譜條件：PrevailTM Organic Acid色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm）；流動相為0.01 mol/L磷酸二氫鉀水溶液，用一定濃度磷酸調節pH值為3.0，等度洗脫；流速為 1 mL/min，檢測波長為210 nm，柱溫為30 ℃。結果如圖3所示?？偹岷坎捎秒娢坏味ǚy定。

1.3.4總糖含量測定總糖含量采用硫酸-蒽酮比色法測定。

1.3.55-羥甲基糠醛（5-HMF）測定取4份10 g五味子鮮果勻漿，分別加水20 mL，進行以下處理：（1）密封于4 ℃冰箱中，冷浸提取5-HMF 24 h；（2）加入定量5-HMF標準品，密封于4 ℃冰箱中，冷浸提取5-HMF 24 h；（3）密封于4 ℃冰箱中，冷浸提取5-HMF 24 h，再超聲提取40 min；（4）加入定量5-HMF標準品，密封于4 ℃冰箱中，冷浸提取5-HMF 24 h，再超聲提取40 min。采用液相色譜儀對提取液進行測定，色譜條件為：Diamonsil C18（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈 ∶水=8 ∶92，等度洗脫；流速為 1 mL/min，檢測波長為284 nm，柱溫為30 ℃。

1.3.6不同生長期五味子綜合評價選擇與五味子產量和功效密切相關的果實與種子干質量、縱橫徑、體積及木脂素類、總糖、有機酸等成分含量共26個指標，建立五味子不同生長期綜合評價體系，運用主成分分析方法對五味子不同生長期樣品進行多指標分析。

2結果與分析

2.1五味子果實與種子的生長發育

2.1.1果實生長發育動態由表1可見，在生長期內，果實的橫徑、縱徑、干質量、鮮質量、體積大部分都呈現不斷增加的趨勢，且除含水量各指標基本在9月中旬達到最大值；果實顏色由綠色或黃綠色逐漸變為紅色或鮮紅色，其中8月底至9月初為五味子紅色變色期；7月中旬，五味子果實橫徑、縱徑分別為采收時（9月15日）的67.2%、74.1%，體積為采收時的55.9%，干質量為采收時的28.3%，6月份的迅速生長對五味子漿果大小有著基礎性的作用；8月10日，采收的樣品中已有紅色出現，但大部分還為黃綠色；8月末，果實已基本變紅，但還有少許綠色；9月上旬，果皮紅色加深，并伴隨果實變軟，果實橫徑、縱徑、體積、鮮質量無明顯變化。表1五味子鮮果各生長發育階段果實的外觀指標（x±s，n=3）

2.1.2種子生長發育動態由表2可見，種子的橫徑、縱徑、干質量、體積整體上隨果實生長發育而增大，含水量在一定時間內逐漸降低。7月上旬，種子的橫徑、縱徑達到采收時的97%，說明種子在坐果后生長很快，在6月末已經基本形成，此時種皮較脆，含水量較高，顏色呈現黃色，其干質量為采收時的32.1%；8月上旬，種子顏色略有加深，基本呈現成熟種子的顏色，且硬度增加，干物質積累迅速，為采收時的70.9%，較7月份增加1倍多，但種子的橫徑、縱徑變化不大；9月上旬，種子干質量為采收時的96%，這說明物質積累已經基本完畢，顏色也已成為成熟種子的顏色，9月5日至15日，種子橫徑、縱徑變化已不明顯。表2五味子鮮果種子各生長發育階段指標（x±s，n=3）

2.2五味子鮮果木脂素類成分含量變化動態

由表3可見，整個生長期內，五味子鮮果木脂素類成分成分呈現先升高后降低或后期略有回升趨勢，整體呈現倒“V”形分布；五味子醇甲、五味子醇乙、當歸酰戈米辛H、五味子甲素、五味子乙素5種木脂素成分含量相對較高。7月份，各木脂素成分含量已達到一定水平，這是由于木脂素類成分大部分存在于種子中，7月份種子已基本成型；8月初，木脂素各成分含量急劇增加，木脂素各成分含量相對最高；8月末，木脂素含量又有所降低，此時正值五味子紅色素形成、果實由綠轉紅的階段；9月，不同木脂素成分表現出不同的變化趨勢，這可能是由于不同木脂素成分在果實中的生理作用不一樣，不同木脂素在果實成熟過程中參與了生理生化反應。表3五味子鮮果木脂素各成分的含量（n=3）

采樣日期

（月-日）五味子醇甲（%）戈米辛D（%）戈米辛J（%）五味子醇乙（%）當歸酰戈米辛H（%）當歸酰戈米辛Q（%）含量RSD含量RSD含量RSD含量RSD含量RSD含量RSD07-120.364f0.550.058f1.720.068b1.470.168c0.590.098e1.020.038b1.6308-100.791a1.640.100a1.000.070a1.430.210a0.950.182a1.650.050a1.8608-310.546e0.730.076d1.320.056d1.790.153e1.740.121d1.740.032c1.7409-050.591d1.020.064e1.560.053e1.890.157d0.640.121d0.830.026d1.8409-100.643c1.690.079c1.270.057d1.750.153e1.310.141b0.710.027d1.7009-150.671b0.920.098b1.020.060c1.670.199b0.500.130c0.740.022e1.55采樣日期

（月-日）戈米辛G（%）五味子酯甲（%）五味子甲素（%）五味子乙素（%）五味子丙素（%）木脂素總和（%）含量RSD含量RSD含量RSD含量RSD含量RSD含量RSD07-120.059b1.690.036e1.860.080e1.250.230e0.870.057b1.751.256e2.6208-100.068a1.470.067a1.490.148a1.350.337a1.480.063a1.592.086a2.2108-310.057c1.750.054b1.740.120c1.670.274c1.460.055c1.811.544d1.1709-050.050d1.830.041c1.580.132b1.520.250d1.870.055c1.791.540d1.3009-100.050d1.680.039d1.420.147a1.360.268c1.120.062a1.611.676c1.7309-150.049d1.740.032f1.660.113d0.880.314b1.830.058b1.571.752b1.47

2.3五味子鮮果維生素C、酸類成分、糖含量變化動態

由表4可見，在五味子部分生長期內，果實維生素C含量呈現降低趨勢，7月初至8月末急劇降低；L-蘋果酸在7月份未檢測到，可能是由于含量較低或者還未生成，8月份開始逐漸積累，9月份含量持續增加；莽草酸含量在7月份時較高，隨果實生長發育呈現一定程度的降低趨勢；檸檬酸在7月份時含量較低，8月份急劇增加，后隨果實成熟，含量略有降低；果實總酸含量總體表現出升高趨勢，這是由于隨果實生長發育，從果實以外器官運輸到漿果中的酸逐漸增加，同時漿果本身合成酸的能力逐漸增強，從而導致漿果中酸含量逐漸升高；果實總糖含量在9月初達到最高值，隨果實成熟又有所下降，這是由于漿果生長前期，進入漿果中的糖分除用來提供能源、用于漿果的呼吸作用和細胞的增殖與增大，還被用來合成細胞壁、原生質等，因此，五味子早期糖分含量較低，始熟期后，果實以外的器官運輸到漿果中的糖分增加，或可能由多糖、有機酸向單糖轉變而使其糖含量提高，但在果實轉色期后總糖含量又有所下降。表4不同生長期五味子鮮果維生素C、酸類成分、糖的含量（n=3）

采樣日期

（月-日）維生素C（%）L-蘋果酸（%）莽草酸（%）檸檬酸（%）總酸（%）總糖（%）含量RSD含量RSD含量RSD含量RSD含量RSD含量RSD07-120.498a1.20未檢出-6.513a0.717.082e1.658.80d1.143.91f2.9508-100.379b1.32未檢出-4.379b0.7513.709b1.6714.03c1.508.13e3.1108-310.269c1.121.450d1.862.626d0.9114.403a1.6516.38b1.1617.81b2.1809-050.272c1.473.137c1.692.712c0.9913.814b1.8414.44c2.1523.08a3.4509-100.258d1.383.795b1.791.845f1.7411.833d1.8316.21b2.5914.25d2.9809-150.265c1.254.336a1.452.026e1.7712.540c1.7118.23a1.9216.62c3.14

2.4五味子鮮果5-HMF成分測定

試驗結果（圖4）表明，加入標準樣品的2種提取液均檢出5-HMF；標準品加樣冷浸提取和超聲提取，回收率分別為99.22%、98.94%。這說明試驗采用的方法能夠使5-HMF穩定存在，5-HMF并非五味子的原始積累成分。

2.5主成分分析

主成分分析結果表明，F1、F2、F3主成分因子在五味子質量評價中起著主導作用，3個主成分的累積貢獻率達9510%，能夠較客觀地反映五味子的質量，故選取主成分F1、F2、F3進行分析。依據五味子不同生長期樣品主成分因子得分結果，以每個主成分所對應的特征值作為權重計算綜合模型F（表5），并按照得分值進行排序，綜合得分越高，表明果實越成熟，品質越好，但如果實過于成熟，會導致植株落穗、落果從而減產，同時在采收運輸過程中會導致果實大量破損，從而導致在干燥過程中有害成分5-HMF含量過高而影響藥材品質。綜合遼寧省產地實際情況，建議9月上旬五味子果實全部變紅即可采收，此時，不但外觀色澤符合傳統用藥習慣，成分含量也能達到藥典規定要求，且不含有害成分5-HMF；另外，比傳統采收時間提前7 d左右，避開了產地農忙時節，降低了采收成本，保證了藥材質量。

3結論與討論

3.1采樣時間的確定

遼寧產地五味子一般于5月中下旬開花，花期15 d左右，6月上旬初見果形，9月中旬開始采收。由于考慮五味子果實發育早期果粒相對較小，難以形成產量，不具有實際應用

表5不同生長時期五味子主成分分析得分及排名

生長時期

（月-日）F1F2F3F得分排名得分排名得分排名得分排名07-12-6.696-2.7260.652-4.63608-10-2.5355.301-0.3340.12508-311.114-0.664-1.6960.32409-052.163-1.805-1.2350.61309-102.752-0.2730.5731.55209-153.2010.1722.0312.041

價值，因此試驗選擇在7月、8月上旬各采樣1次，8月末五味子果實成熟前期適當增加采樣次數，在8月31日至9月15日采樣4次，重點考察成熟期階段果實和種子及其化學成分的變化。

3.2果實生長發育

果實大小是果實外觀品質的重要指標，與果實縱徑、橫徑的發育密切相關。坐果后，果實經過連續的細胞分裂、細胞膨大會表現出一定的生長動態。果實細胞分裂與膨大除受遺傳因素制約外，還受內源激素、營養物質及環境、土壤等因素的影響[4]。種子是漿果產生激素的中心，五味子種子在6月份就已基本形成，因此開花前期的營養水平關系到種子的發育，進而影響到果實大小。目前，關于氣象環境因素調控果實生長發育的研究較少，如劉實等在長春地區針對氣象因子對北五味子生長特性的影響進行了研究[5]，相關基礎研究還相對薄弱。

3.3五味子果實生長期主要化學成分含量的動態變化

藥用植物中所含的有效成分是防病、治病的物質基礎，多為植物的次生代謝產物。藥用植物在生長發育過程中，有效成分的合成積累呈現一定的規律性。組成木脂素的單體主要有桂皮酸（偶有桂皮醛）、桂皮醇、丙烯苯和烯丙苯4種[6]，木脂素類成分是葉片次生代謝的產物[7]。9月中旬，五味子植株葉片大部分仍然保持綠色，這說明良好的栽培管理降低了葉片的病蟲危害，能夠保證果實木脂素含量達到較高的水平。在整個生長發育階段，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素含量相對較高，而五味子醇甲、當歸酰戈米辛H、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素為入血成分[8-9]，將這幾個成分納入質量控制指標更為合理。不同產地采收的五味子木脂素含量差異很大[10]，這可能與種質、氣候環境、栽培措施等不同有密切關系。

果實生長過程中，有機酸含量的增減與磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）等關鍵酶發揮作用密不可分。有機酸在果實自身代謝中參與光合作用、呼吸作用，以及合成酚類、氨基酸、酯類和芳香物質等[11]，果實發育過程中的有機酸代謝及其變化，影響著成熟果實的有機酸含量。果實有機酸代謝是一個極為復雜的過程，有機酸含量及組成是內在遺傳特性、外在自然環境因子和栽培措施等多因素共同作用的結果。有文獻報道，五味子果實中含有酒石酸、奎尼酸[12-13]。在本試驗樣品中，只發現含有L-蘋果酸、莽草酸、檸檬酸，這可能是由于不同的種質處在不同栽培環境條件所引起的，這也為五味子產地差異化鑒別提供了可能。

五味子鮮果花色苷主要成分為矢車菊-3-O-木糖鼠李糖苷[14]，糖對花色素形成有極為重要的作用。9月5日前后，遼寧省五味子糖類成分達到1個峰值，此時正值五味子漿果紅色素形成期，因此，要促進果實色澤發育，需要提高果實的含糖量。

3.45-HMF成分定性測定

有文獻報道，5-HMF可能引發結腸小囊異常生長[15]，產生一定程度的基因毒性[16-17]，對人體橫紋肌和內臟有損害，能與人體蛋白質結合產生蓄積中毒[18]。試驗采用冷浸法和超聲提取法的同時，運用回流法提取，考察不同時期五味子形成5-HMF的條件，結果表明，不同生長期的五味子樣品回流提取液一直存在5-HMF，而鮮果超聲和冷浸提取液中未檢出，這說明五味子在加熱過程中很容易產生5-HMF。鮮果中不存在5-HMF，這為尋找低含量5-HMF的加工方法提供了思路。

3.5五味子適宜采收期的確定

研究早期，往往以單一的五味子醇甲作為五味子質量控制指標來評價其質量，隨著五味子藥理研究的不斷深入，研究者逐漸認識到五味子發揮藥效的物質不單單是五味子醇甲，而是多個成分的協同作用，除木脂素類成分外，多糖類和有機酸類成分也是五味子物質基礎的重要組成部分。五味子多糖在保肝、抗疲勞、降血脂、抗突變等方面具有一定療效[19]，有機酸類成分對心血管系統疾病具有潛在的臨床應用價值[20]。單一比較某種化學成分含量的高低也不能完全說明五味子的品質。

主成分分析是一種較為客觀的評價方法，根據每個主成分的得分來衡量指標的程度和地位，進而構建綜合評價函數，對研究對象進行綜合評價，在研究過程中不需要人為確定指標權重，減少了人為誤差。本試驗根據主成分分析的理論和方法，對不同生長期五味子進行綜合評價，擺脫了單獨以五味子醇甲含量評價五味子的片面性，同時避免了人為劃定權重的影響。對五味子產量和質量相關聯的26個指標運用多指標綜合評價模式對五味子適宜采收期進行研究，結果表明，遼寧省產地應于9月上旬開始采收五味子，需在15～20 d采收完畢。若不及時采收，五味子果實過度成熟變軟，會自動脫落，給采收帶來困難；同時，9月正是遼寧省產地農忙時節，五味子藥材采收需要大量的人力，過遲采收不利于勞動力的資源配置。

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