四唑染色法測定巨紫荊種子生活力

凌敏　楊秀蓮　王良桂

摘要：為探討巨紫荊（Cercis gigantea）種子生活力的適宜測定方法，采用四唑染色法，以染色濃度、染色溫度、染色時間設計正交試驗，研究巨紫荊種子的生活力測定條件。結果表明，染色濃度、染色溫度、染色時間3者之間存在一定的關系，TTC濃度為0.1%、溫度為35 ℃、染色時間為8 h是巨紫荊種子生活力測定的最佳條件。

關鍵詞：巨紫荊種子；四唑染色；生活力

中圖分類號： S339.3+1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0295-03

收稿日期：2014-03-05

基金項目：江蘇省林業三新工程項目（編號：lysx[2013]24）。

作者簡介：凌敏（ 1990—），女，安徽滁州人，碩士研究生，研究方向為園林植物與應用。E-mail：974574883@qq.com。

通信作者：王良桂，教授，博士生導師。E-mail：wlg@ njfu.com.cn。巨紫荊（Cercis gigantea）原產中國浙江、河南、湖北、廣東、貴州等地，是現存極少的鄉土樹種。巨紫荊是高大落葉喬木，高可達15 m，胸徑可達40 cm。樹干通直，生長整齊，枝展開張，樹冠綠蔭面積大，覆蓋度高，園藝性狀突出，適宜作行道樹、庭蔭樹，藝術效果良好。巨紫荊春季滿樹開淡紅或淡紫紅花，先花后葉，燦若云錦，觀賞效果極佳；夏季葉綠莢紅，茵質濃厚；秋季彩葉如霞；冬季落葉后莢果仍然懸掛枝頭，盡展生命之勁力。巨紫荊實乃春季觀花、夏秋觀葉、冬季觀果的優良園林樹種，是園林綠化中具有廣闊應用前景的鄉土樹種[1]。在小苗培育方面，巨紫荊的出苗率一直不高，播種前用濃硫酸酸蝕再用赤霉素浸泡，其發芽率最高僅有25.5%[2]。準確的生活力測定方法能夠真實反映種子的發芽能力，尤其對一些休眠期長的種子更為適用。四唑（2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC）測定技術是通過鑒定種子內部活組織的染色情況測定種子活力，是國際上公認的測定種子生活力較好的方法，能夠快速、有效、準確地反映出種子的生活力，是《國際種子檢驗規程》中用于測定發芽緩慢或有休眠種子的生活力、快速判斷種子潛在發芽能力的一種有效方法[3-5]。

本研究利用四唑染色法，設置不同的TTC 濃度、染色溫度和時間，研究巨紫荊種子生活力測定的適宜條件，探究巨紫荊種子生活力的快速測定方法，為客觀評價巨紫荊的發芽能力，科學預測種子用量以及出苗率等提供理論參考。

1材料與方法

1.1材料

巨紫荊種子于2013年11月12日采自南京林業大學梁希廣場前，種子的凈度為96.12%，千粒質量為21.50g，含水量為17.15%。

1.2TTC染色法

1.2.1正交試驗采用正交試驗設計方法，確定巨紫荊種子生活力測定的適宜條件。選擇 TTC 濃度、染色溫度（烘箱溫度）和時間等直接關系種子活力測定結果的3個因素，并設置3個不同的水平，進行正交試驗（表1）。

表1TTC染色法測定因素與測定水平

水平因素A：TTC濃度

（%）B：染色溫度

（℃）C：染色時間

（h）10.1025820.15301230.203516

1.2.2TTC溶液配制用超純水分別將 TTC 配成0.1%、015%、0.2%濃度的溶液，pH 值范圍為 6.8～7.2，保存于棕色瓶中。

1.2.3浸泡處理隨機抽取27份巨紫荊種子，每份50粒，去子葉末端，放置于27個燒杯中，加入25 mL自來水中淹沒種子，置于25 ℃恒溫培養箱中24 h，待其吸水膨大后取出，用刀片及解剖針剝去種子的3層種皮，取出胚，供染色用。整個操作過程中，所有的種子都置于濕潤的脫脂棉上，以保證種子的濕潤。

1.2.4染色將準備好的每份50粒種胚分別放入27個小燒杯中，共9個處理，每個處理重復3次，加入對應的TTC溶液，分別放入25、30、35 ℃的烘箱中避光染色。達到染色時間后，取出種胚，用清水沖洗，將種胚擺在濾紙上，根據種子染色的部位、染色面積的大小和染色程度，逐粒判斷種子的生活力[6]。

1.3TTC濃度試驗

在35 ℃條件下，進行了不同濃度的TTC液（03%、04%、05%）對種子染色數目、染色時間及染色程度的比較試驗。

1.4種子發芽與生活力測定

根據不同的處理方法將隨機抽取的巨紫荊種子分為2大組10小組。（1）98%濃硫酸處理組：處理時間分別為10 min（處理1）、15 min（處理2）、20 min（處理3）、25 min（處理4）、30 min（處理5），處理對應時間后，再分別置于流水下沖洗 48 h。（2）熱水浸泡48 h組：浸泡溫度分別為50 ℃（處理6）、60 ℃（處理7）、70 ℃（處理8）、80 ℃（處理9）、90 ℃（處理10）。每組3個重復，每個重復100粒，處理完畢后進行發芽試驗，將種子置于濕潤的砂子中，25 ℃培養溫度，每天光照 12 h，光照強度 為1600 lx，期間保持發芽盒內砂子濕潤[7]。

2結果與分析

2.1TTC濃度、染色溫度和染色時間對種子生活力的影響

采用四唑染色法測定巨紫荊種子生活力的正交試驗 L9（33） 試驗結果見表2。巨紫荊種子生活力最高（99.33%）的處理組合為0.15%TTC濃度、35 ℃染色溫度、8 h染色時間（處理組合6），以及0.20% TTC濃度、35 ℃染色溫度、12 h染色時間（處理組合9）；生活力最低（0.67%）的處理組合為0.10% TTC濃度、25 ℃染色溫度、8 h染色時間（處理組合1），低于最高生活力98.66%。endprint

將所得數據進行方差分析，結果見表3。染色溫度以及染色時間的F值（53.72、20.78）均遠大于F0.01（3.92），表現差異極顯著；TTC濃度的F值（1.63） 小于F0.01，差異不顯著。3個因素對巨紫荊種子生活力的影響大小排序為溫度>時間>TTC 濃度。

各因素不同水平的種子生活力平均值比較結果見表4。隨著TTC濃度升高，種子的活力呈現先上升后下降的趨勢，但是其變化幅度不大，從節省原料的角度出發，可以考慮選擇低濃度的TTC；染色溫度越高，巨紫荊種子的活力越高，當溫度為35 ℃時，巨紫荊種子的活力達到98.66%，而且隨著溫度升高，差異顯著，35 ℃條件下巨紫荊種子的活力比30 ℃條件下提高了38.88%；隨著染色時間延長，種子活力也上升，表現差異顯著，但相對于溫度來說，其影響程度還是很小。綜上所述，結合節約資源、減少污染的實際情況，TTC 法測定巨紫荊種子生活力的最佳條件為0.10% TTC濃度溶液，在 35 ℃ 烘箱中染色8 h。

表2TTC染色法正交試驗結果

處理組合因素ABC種子活力

（%）11110.67212261.33313397.3342122.00 522397.33623199.33731364.67832120.67933299.33

表3TTC濃度、溫度、浸種時間處理的巨紫荊種子

生活力測定方差分析

來源dfSSMSF值F0.01因素A2198.7499.371.633.92因素B26536.973268.4853.72因素C22528.071264.0420.78誤差271642.5460.84

2.2TTC濃度與染色時間的關系

不同濃度TTC液（0.3%、0.4%、0.5%）對種子染色數目、染色時間及染色程度的比較試驗結果見表5。

表4不同水平的巨紫荊種子生活力平均值比較

水平種子生活力平均值（%）TTC濃度染色溫度染色時間153.11c22.45c40.22c266.22a59.78b54.22b361.56b98.66a86.44a注：同列中不同小寫字母表示在P<0.05水平上表現差異顯著。

表5不同濃度TTC液的染色情況

TTC濃度

（%）試驗種子數

（粒）染色種子數

（粒）著色穩定時間

（h）0.3504960.4505040.550494

結合TTC濃度試驗結果，可以看出只要染色溫度適宜，TTC濃度對巨紫荊種子活力的影響不大，不論濃度高或低，均能染色；TTC濃度高時，可以縮短染色時間。出于節約試劑、減小污染的目的，在試驗時盡可能選擇較低濃度染色。根據上述結果，TTC 法測定巨紫荊種子生活力的最佳條件與正交試驗結果一致。

2.3種子發芽率與種子生活力的關系

試驗進行30 d 后種子均未見萌發，繼續觀察1個月后，僅有個別種子開始出現霉爛現象，但是仍然沒有萌發跡象。此時每個處理隨機抽取 50 粒種子，用四唑染色法測定其種子的生活力。由表 6 可知，絕大多數成熟的巨紫荊種子具有良好的生命活力；在進行發芽試驗時，適當的處理方法對種子之間生活力影響不大。

表6巨紫荊種子生活力測定結果

處理有生活力種

子數（粒）無生活力種

子數（粒）發芽種子數

（粒）發霉種子數

（粒）1482002491003455004462025431246473007500008473009454011042404

3結論與討論

種子生活力反映了種子的發芽潛在能力和種胚所具有的生命力，是判斷種子質量的重要指標[8]。四唑染色法是國際公認較好的測定種子活力的方法，已廣泛應用于農作物和蔬菜種子的活力測定。由于TTC濃度、染色溫度以及染色時間等的不同都會影響種子的活力判斷，因此針對不同植物種子需要確定不同的活力測定條件。對巨紫荊種子生活力進行測定前，對測定巨紫荊種子生活力的TTC濃度以及染色溫度作了簡單的對比，結果表明當TTC濃度低于0.10%、染色溫度高于50 ℃時，巨紫荊種子不染色或者染色情況較差，故試驗時將TTC濃度設置高于0.10%，染色溫度低于50 ℃。

TTC濃度、染色溫度、染色時間均為影響巨紫荊種子生活力的重要因素，其中染色溫度及時間對生活力的影響極顯著，在生活力測定中存在一定的線性關系，可以通過改變TTC濃度、染色溫度、染色時間其中的兩者而達到改變第3條件的目的[9]。染色溫度為生活力測定的最主要限制因子，控制好染色溫度對巨紫荊種子生活力的測定具有重要意義。

從節約成本減少污染角度出發，可以通過降低TTC濃度、提高染色溫度達到良好的染色效果[10]。生產上可根據實際情況，選擇適宜的染色濃度（0.1%～0.2%），在35 ℃下染色8 h或者在較高濃度（0.3%～0.5%）下于35 ℃染色4～6 h。根據本試驗研究結果，種子生活力的最佳測定條件為0.1% TTC濃度溶液、 35 ℃染色溫度、8 h染色時間。

前人試驗表明，TTC 染色法測定結果與標準發芽率一般很接近，是最有希望代替發芽試驗的方法[11-13]。但本研究結果表明，巨紫荊種子生活力和其發芽試驗結果相差很大，TTC 染色法還不能取代巨紫荊種子的發芽試驗。這主要在于巨紫荊種子萌發還沒有建立起標準的發芽方法，在后續的試驗中將對巨紫荊種子萌發的相關生理特性進行深入研究，以提高其生活力測定結果判定的準確性，從而為估測巨紫荊種子發芽率提供一種準確、快速、簡便和適用的新方法。

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