不同基因型玉米耐鋁特性比較

邵繼鋒　車景　董曉英　+等

摘要：以相對根伸長率為指標，對26個玉米基因型進行耐鋁特性篩選。結果表明：26個供試基因型中，農大4967相對根伸長率最大，鄭單2201相對根伸長率最小。比較了鋁處理下農大4967、鄭單2201根尖鋁和胼胝質含量，發現農大4967根尖鋁和胼胝質含量顯著小于鄭單2201。蘇木精染色及桑色素熒光染色觀察表明，農大4967根表和橫切面鋁的分布都低于鄭單2201，且鋁主要積累在根表。以上結果表明，農大4967為鋁耐受型基因型，鄭單2201是鋁敏感型基因型，玉米耐鋁機制以外排機制為主。

關鍵詞：玉米；鋁毒害；鋁敏感型；鋁耐受型

中圖分類號： S513.034文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0061-04

收稿日期：2014-03-29

基金項目：國家自然科學基金（編號：41025005）。

作者簡介：邵繼鋒（1983—），男，浙江建德人，博士研究生，從事植物鋁毒害和耐鋁機制研究。E-mail：brianshao888@gmail.com。

通信作者：沈仁芳，研究員，從事植物營養和逆境生理研究。E-mail：rfshen@issas.ac.cn。全世界酸性土壤有39.5億hm2，其中可耕種面積為1.8億hm2，主要分布在熱帶、亞熱帶及溫帶地區[1]。我國酸性土壤遍及南方15個省區，總面積為 2 030萬hm2[2]。酸性土壤往往同時存在多種限制作物生長的因子，如鋁毒害、錳毒害、磷缺乏等[3]，其中鋁毒是酸性土壤對作物生長和產量的主要限制因子之一，世界糧食作物產量特別是谷類作物產量，嚴重受到鋁毒影響。因此，鋁對植物的毒害和植物的耐鋁機制受到國內外學者關注，對酸性土壤中鋁毒害的調控措施主要有施用石灰、有機肥、綠肥等土壤改良措施以及選育耐鋁性強的基因型品種[4]。其中從基因工程角度篩選和培育耐鋁品種已經成為研究熱點。

玉米（Zea mays L.）是世界第三大糧食作物，玉米不適宜在酸性土壤上種植，主要原因就是鋁毒害。不同基因型玉米的耐鋁毒特性存在明顯差異，篩選、培育出耐鋁毒的玉米品種，可以擴大玉米種植帶，解決南方地區酸性土壤發展玉米生產的限制問題，對提高糧食產量具有重大意義[5]。刁銳琦等對26個基因型玉米苗期株高、吸氮量、氮素轉化率等進行比較，篩選出耐低氮的種質材料3個[6]。許玉鳳等通過對7個玉米品種研究指出，可以通過比較生物量來篩選耐鋁材料[5]。有多種方法可用于評價植物的耐鋁性，包括量取根的伸長、測定根尖鋁含量以及評價生物量等[7-9]。由于鋁對植物毒害作用的最明顯特征就是抑制根伸長，因此其常被用來衡量植物受到鋁毒害程度的參數[10-11]。本研究通過比較26個推廣范圍較大的玉米基因型在鋁脅迫下的相對根伸長率，篩選出鋁的不同耐受型，并比較獲得的玉米基因型的耐鋁特性，探索其耐鋁特性，旨在為揭示玉米耐鋁機制提供研究材料，并為耐鋁品種選育提供理想的種質資源。

1材料與方法

1.1供試材料

供試玉米品種為推廣種植面積較大的農大4967、農大86、豫玉32等26個玉米品種（表1）。

表1供試玉米基因型編號及名稱

編號名稱編號名稱編號名稱編號名稱1紀元一號8中金36815華珍229982鄭單9589浙糯玉5號16俊達00123喜玉123光玉33510東糯4號17鄭單220124鄭農72784京單6811科甜2號18費玉三號25秦龍145京單2812科糯98619偃單8號26豫玉326農大496713鄭單2220浚單227農大8614花甜糯07221栗玉2號

1.2試驗方法

選擇飽滿一致的玉米種子，用5%次氯酸鈉消毒30 min，經蒸餾水沖洗3次后，25 ℃下用蒸餾水浸泡2 h，然后將種子置于濕潤濾紙上25 ℃避光催芽2 d，移至漂浮在0.5 mmol/L CaCl2溶液 （pH值4.5）中的浮板上培養1 d。選取長勢一致的幼苗，用含0、25 μmol/L AlCl3的0.5 mmol/L CaCl2溶液（pH值4.5）處理1 d。處理前后用直尺量取根長，計算相對根伸長率，重復10次。相對根伸長率（RRE）計算方法如下：

RRE=（RLAl，t-RLAl0）/（RLC，t-RLC0）×100% 。

式中：RLAl，t為鋁處理t時間后的根長；RLAl0為鋁處理前的根長；RLC，t為對照處理t時間后的根長；RLC0為對照處理前根長。

1.3測定項目與方法

1.3.1根尖鋁含量測定根尖總鋁含量測定方法參照文獻[12]。切取鋁處理1 d后的玉米根尖（0～1 cm）10條，用 0.5 mmol/L CaCl2溶液沖洗3次后，放入裝有1 mL 2 mol/L HCl的離心管中，間斷搖動。放置1 d后用ICP-AES（IRIS-Advantage，Thermo Element）分析儀測定，每個處理重復3次。

1.3.2胼胝質含量測定胼胝質含量測定方法參照文獻[13]。切取鋁處理后的玉米根尖（0～1 cm）10條，放入95%乙醇溶液中4 ℃保存過夜后，用1 mol/L NaOH溶液 1 mL研磨提取并轉移至1.5 mL Eppendorf管中，80 ℃水浴20 min，冷卻至室溫，12 500 r/min離心10 min，吸取上清液400 μL于10 mL離心管中，并加入2.5 mL苯胺藍混合液，另吸取 400 μL 上清液于10 mL離心管加入2.5 mL苯胺藍空白混合液，混勻后于50 ℃水浴20 min，室溫冷卻，于激發光波長 400 nm 和發射光波長485 nm條件下用熒光分光光度法測定熒光值。標準曲線配制如下：以20 μg/mL Pachyman（PE）作為標準溶液，測定前同樣品一起80 ℃水浴20 min后，冷卻至室溫，分別吸取0、50、100、150、200、250、300、350、400 μL各2個平行于10 mL離心管，補充1 mol/L NaOH至500 μL，于1組標準曲線中加入2.5 mL苯胺藍混合液，另1組標準曲線加入2.5 mL苯胺藍空白混合液，其他后續工作同樣品，測定其熒光值。計算樣品胼胝質含量時，用所測苯胺藍濃度減去空白液所測濃度即為樣品胼胝質濃度，根據體積換算至每條根的含量，單位為 PE μg/根。

1.3.3蘇木精染色蘇木精染色法作為組織化學的指示物，常被用來觀察根尖鋁分布情況[14]。配制0.2%蘇木精加002% KIO3溶液，然后加入1滴0.1 mol/L NaOH。幼苗經鋁處理后，用蒸餾水沖洗，室溫下將植物根系放入裝有蘇木精溶液的培養皿中浸泡40 min，中間間斷搖動溶液，以便染色均勻。然后用蒸餾水沖洗浸泡，去掉過量的蘇木精，每次浸泡10 min，沖洗2～3次。在體視顯微鏡（Olympus-SZX7）下觀察。所得圖像用DT2000通用圖像分析軟件進行分析處理。

1.3.4桑色素熒光染色選取桑色素（Morin）為熒光物質，進行桑色素熒光染色[15]。切取鋁處理后的幼苗根尖（2 cm左右），徒手切片，在根尖2 mm處橫切，將切得的橫切面放入配制好的桑色素溶液中染色15～30 min。取出后用蒸餾水沖洗3遍。在激光共聚焦上觀察（激發波長420 nm，發射波長510 nm，Axivoert 40 CFL，Carl Zeiss，Germany）。用AxioVision-Ac圖像軟件處理圖像。桑色素溶液母液配制：稱取2 mg桑色素溶于 2 mL 二甲亞楓（DMSO），加水稀釋至10 mL。

2結果與分析

2.1相對根伸長率比較

植物鋁毒害最容易識別的形態癥狀就是根生長受到抑制，鋁毒抑制根的生長可以在1 h甚至更短時間內測量出來[16]。肉眼可見的鋁毒害癥狀包括根伸長生長的抑制、根尖膨大、表皮脫落等[17]。因此通過比較根在鋁脅迫下的伸長量是篩選不同耐鋁性植物品種的重要指標。由圖1可見，在 25 μmol/L 鋁脅迫下，不同玉米基因型相對根伸長率有很大差異，農大4967根伸長受抑制程度最輕，其次是偃單8號，鄭單2201根伸長受抑制最重，其相對根伸長率不到農大4967的50%。通過比較相對根伸長率，農大4967、鄭單2201分別被選為耐鋁基因型和鋁敏感基因型進行下一步試驗。

2.22個玉米基因型耐鋁特性比較

2.2.1根尖鋁含量比較根尖是對鋁最敏感的區域，是鋁毒害的首要發生位點[18]。因此根尖鋁含量可被用于直觀比較2種材料對鋁的累積差異。由圖2可知，在25 mol/L鋁處理下，鄭單2201根尖積累了大量的鋁，顯著高于農大4967，t檢驗結果發現，F=1.697，P<0.05，說明2種材料在鋁累積方面存在較大差異，且在耐鋁機制上可能以排斥機制為主。

2.2.2胼胝質含量作為鋁毒害的重要生理指標之一，鋁脅迫誘導生成胼胝質可以在根系生長受抑制前被檢測出來，同時胼胝質的生成可以用作鋁敏感基因型差異的指標[19-20]。由圖3可見，在25 μmol/L鋁脅迫下，鄭單2201根尖胼胝質含量顯著大于農大4967，t檢驗結果發現，F=1.043，P<005，說明鄭單2201對鋁的毒害更加敏感。

2.2.3蘇木精染色蘇木精易與根系結合的鋁形成藍紫色復合物，染色程度越深，代表根尖鋁積累量也越多， 蘇木精染

色法因此被廣泛應用于觀察根系鋁的累積情況[21-22]。由圖4可見，經25 μmol/L鋁處理后，在體視顯微鏡下觀察的根尖影像中，農大4967根表顏色較淺，而鄭單2201根表整體顏色很深，整個根表都被染色。說明有更多的鋁結合在鄭單2201根表，而農大4967則相對少很多。因此， 鋁處理后積累在鄭

單2201根尖表面的鋁遠多于農大4967根尖表面積累的鋁，這和實際測出根尖的鋁含量一致。

2.2.4桑色素熒光染色蘇木精染色旨在觀察鋁在玉米根系表面的積累情況，而不能有效觀察進入根內部的鋁。桑色素熒光染色法對觀察鋁在植物內部微觀分布獨具功效，許多研究采用熒光染色法研究鋁的微觀分布狀況[23-24.]。從圖5-b可見，鄭單2201根尖2 mm處橫切面從外層細胞到內層中柱熒光強度逐漸減弱，說明根的皮層、內皮層甚至中柱也有一定量鋁進入，離根表越遠進入的鋁越少。而農大4967則不同，熒光強度在外表層最強，然后逐漸減弱，雖然在切面內部可以看到零星熒光，但強度很弱（圖5-a）。說明農大4967根尖積累的鋁主要分布在根的表層，只有極少部分鋁進入了根內部，進一步驗證了玉米耐鋁的排斥機制。

3結論與討論

通過比較鋁處理1 d玉米根的相對伸長率，初步區分不同基因型玉米對鋁的耐受能力，從26個基因型中篩選出1個鋁耐受基因型和1個鋁敏感基因型。并通過測定根尖鋁和胼胝質的含量，定量鋁對根尖的傷害程度；通過蘇木精染色和熒光染色定性觀察根尖表面和根橫切面鋁的分布，由此確定所篩選玉米基因型的耐鋁特性及可能的耐鋁策略為外排機制。

許玉鳳等比較了京八、沈137、齊139等7個玉米品種在鋁脅迫下的主根長、生物量，篩選出1個耐鋁基因型和2個敏感基因型[5]。李德華等比較了9個基因型玉米根相對伸長率、蘇木精染色指數、根系TTC相對還原強度，得出以上指標與植株的耐鋁性顯著相關[25]。根尖鋁含量和胼胝質含量都可以在一定程度上反映植物或品種間的耐鋁性差異[26]。本研究表明，無論是根尖鋁含量還是胼胝質含量，農大4967都顯著低于鄭單2201，進一步表明2個品種在耐鋁性方面的顯著差異。

根據解毒位點的不同，可將植物的耐鋁機理分為外部排斥機制和內部忍耐機制。其中植物耐鋁的外部排斥機制是指植物根系吸收鋁的過程中能夠通過一定的策略把鋁阻留在根表、根尖或根質外體，或吸收鋁后再將其排出，使之不能與共質體中的代謝位點結合，達到耐鋁毒害的目的[3]。本研究表明，吸附在鄭單2201表面的鋁遠多于吸附在農大4967根表的鋁；鋁可透過鄭單2201根的表層細胞到達中柱，而農大4967則相對較少；同時鋁主要集中在農大4967的根表細胞，說明2種材料在對鋁的排斥方面存在很大差異。自Miyasaka等[27]首次證明根系分泌有機酸是植物耐鋁的重要機理以來，越來越多的證據表明有機酸在植物解鋁毒的內部和外部機制中有重要作用[27-29]。有機酸能夠與鋁形成穩定無毒的螯合物，從而降低鋁的生物毒性，阻止鋁在細胞內的固定，達到解毒目的[30-31]。鋁脅迫下，耐鋁型玉米根尖分泌大量檸檬酸和草酸，而敏感型玉米則很少分泌甚至不分泌有機酸。Pellet等[32]、Jorge等[33]認為檸檬酸等有機酸和鋁螯合，阻止鋁進入根內部是耐受型玉米較耐鋁毒害的原因。本研究中農大4967根表蘇木精染色很淺，桑色素染色的熒光強度主要集中在根橫切面的外圈，說明農大4967有阻止鋁進入根的能力。這可能和根尖分泌有機酸（檸檬酸、蘋果酸）有關。

改良品種、挖掘耐鋁基因潛力一直是科研工作方向之一。玉米品種自交系和雜交種的耐鋁性均存在廣泛的遺傳變異，具有耐鋁性遺傳改良的基因潛力[34]。在小麥、大麥、水稻、燕麥、高粱等作物中已發現了大量耐鋁基因[35-40]，而在玉米中至少發現5個基因組區域和玉米耐鋁毒害有重要關系[41]。如何利用好基因的潛力以及如何培育適宜我國酸性土壤種植的玉米品種，是未來科研人員努力的方向。

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