A2M介導Fas信號傳導途徑提高卵巢癌對鉑類化療的敏感性研究

李夢迪石麗君劉紅梅陽志軍潘忠勉李力2,王琪

作者單位：530021南寧1廣西腫瘤防治研究所實驗研究部；2區域性高發腫瘤早期防治研究教育部重點實驗室（廣西醫科大學）；3廣西醫科大學附屬腫瘤醫院婦瘤科；4廣西醫科大學研究生學院

基礎研究

A2M介導Fas信號傳導途徑提高卵巢癌對鉑類化療的敏感性研究

李夢迪1，4石麗君1，4劉紅梅1，4陽志軍2，3潘忠勉3李力2,3王琪1，2

作者單位：530021南寧1廣西腫瘤防治研究所實驗研究部；2區域性高發腫瘤早期防治研究教育部重點實驗室（廣西醫科大學）；3廣西醫科大學附屬腫瘤醫院婦瘤科；4廣西醫科大學研究生學院

目的探討A2M基因的表達與卵巢癌患者耐藥及預后的關系及其對Fas信號傳導通路的影響。方法利用癌癥基因圖集（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫中鉑類敏感和耐藥的卵巢癌患者的基因表達譜，分析A2M基因在鉑類敏感和耐藥患者中的表達差異。利用已構建的帶有綠色熒光標記的卵巢癌SKOV3敏感細胞（SKOV3-GFP）和順鉑耐藥細胞（SKOV3-GFP/DDPⅡ）進行裸鼠皮下種植，成瘤后分次予以順鉑體內干預，以實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）技術檢測不同次數順鉑干預后的腫瘤組織中A2M mRNA與Fas信號傳導通路上重要節點基因的表達水平。用雙變量線性回歸分析A2M mRNA與所檢測基因的表達量的相關性。結果相對于鉑類敏感病例，A2M mRNA在鉑類耐藥患者中的表達下降（P＜0.05），A2MmRNA的表達與耐藥相關（P=0.02），與卵巢癌患者總生存期、化療間隔生存期和無疾病進展生存期高度相關（P均＜0.001），其表達量越高，患者生存期越長。A2M mRNA以及細胞凋亡相關的Fas信號傳導通路上重要節點基因Fas、FADD、caspase10、caspase9和caspase3隨順鉑注射次數的增加，在耐藥的移植瘤組織中相對低表達（P＜0.001）；而其下游與DNA修復相關的基因PARP1隨順鉑注射次數的增加，在耐藥的移植瘤組織中相對高表達（P＜0.05）。A2M mRNA的表達與Fas信號傳導通路上節點基因的表達存在線性相關（P＜0.05）。結論A2M可能是卵巢癌順鉑耐藥的潛在信號分子，它可能維持腫瘤細胞對鉑類藥物的敏感性。其在耐藥細胞中的低表達可能通過某種機制抑制下游的Fas信號傳導通路，使其傳導失調，最終引起PARP1的表達上調，促進DNA修復，抑制細胞凋亡，誘發卵巢癌細胞對順鉑的耐藥。

卵巢腫瘤；順鉑耐藥；A2M；Fas信號傳導通路；癌癥基因圖集

鉑類藥物是目前臨床上治療卵巢癌的一線化療藥物。而臨床上約80%的卵巢癌患者在多次化療后產生鉑類獲得性耐藥，嚴重影響了患者的預后，產生耐藥后的患者5年生存率僅為20%［1］。研究表明，鉑類獲得性耐藥產生是一個時間依賴的生物學過程［2］。已知的鉑類藥物耐藥機制主要包括：DNA修復能力的提高；藥物在腫瘤細胞內蓄積減少，包括細胞攝入藥物減少和藥物主動外排增加；腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的轉化和解毒功能增強；細胞凋亡傳導通路上調節蛋白的表達改變等。眾所周知，Fas信號傳導通路對細胞凋亡起關鍵性作用。有研究表明，抑制腫瘤細胞的Fas基因后，下游信號傳導通路同樣被抑制，并能增強細胞毒性化療藥物對卵巢癌細胞的毒性，可逆轉卵巢癌細胞對化療的耐受［3］。

本課題組在前期模擬臨床耐藥的過程中，通過活體內連續誘導，建立了裸鼠卵巢癌的順鉑（DDP）耐藥模型，并獲得順鉑獲得性耐藥的SKOV3-GFP/DDPⅡ細胞株［4］。繼之我們對SKOV3-GFP/DDPⅡ耐藥過程進行動態的生物學分析，整和基因表達譜、microRNA譜及蛋白質譜三個水平的數據信息后，篩選到α2巨球蛋白（A2M）在耐藥細胞中均顯著降低。據文獻報道，A2M是血液中的一種大分子血漿蛋白。月irkenmeier等［5］認為老年人血液A2M水平的下降與腫瘤發病率高度相關；最近研究表明，A2M與其細胞膜受體LRP1結合可抑制Wnt/β-catenin腫瘤信號傳導途徑［6］。

在以上研究成果的基礎上，我們利用癌癥基因圖集（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫進一步分析了A2M基因的表達與卵巢癌化療耐藥的相關性。并采用SKOV3-GFP和SKOV3-GFP/DDPⅡ兩種細胞株進行裸鼠皮下種植成瘤，對移植瘤分次進行體內順鉑干預，對所獲腫瘤組織進行實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）檢測，研究了A2M和Fas凋亡信號傳導通路上重要節點基因在鉑類敏感組織和耐藥組織中的表達變化，并對二者的相關性進行了探討，試圖推測A2M是否有助于維持卵巢癌細胞對鉑類藥物的敏感性及其表達變化是否能通過影響下游的Fas信號傳導通路抑制細胞凋亡，從而誘發腫瘤細胞耐藥。

1 材料和方法

1.1 材料

細胞株及實驗動物：SKOV3-GFP細胞株為帶有綠色熒光蛋白（green fluorescentprotein，GFP）綠色熒光標記的卵巢癌SKOV3親本細胞，SKOV3-GFP/DDPⅡ為本課題組前期在裸鼠體內由順鉑誘導的DDP耐藥細胞株，耐藥指數為2.42倍［4，7］。裸鼠（SPF級，月al月/C）由廣西醫科大學動物實驗中心提供（實驗動物合格證號：NO.1011131），均為4周齡左右的雌性裸鼠，體重為18～20 g。

主要試劑：順鉑為山東齊魯制藥有限公司生產，DMEM培養基和胎牛血清購自美國Corning公司。Trizol Reagent為美國Invitrogen公司產品，M-MLV Reverse Transcriptase由美國Promega公司提供，SY月R Premix Ex TaqⅡ購自日本Takara公司，基因引物由美國Invitrogen公司合成，實時熒光定量PCR儀為美國生產（A月I7300型）。

數據來源：TCGA數據庫是目前世界上最大的癌癥基因數據庫，由英國帝國理工大學HaniGabra教授惠贈，含497例卵巢癌患者的全基因表達譜數據及臨床預后資料，患者的臨床資料見文獻［8］。其中卵巢癌鉑類耐藥89例，鉑類敏感165例，未確診鉑類耐藥243例。

1.2 實驗方法

1.2.1 裸鼠皮下移植瘤鉑類耐藥模型按本課題組前期研究的方法［4］，以10%胎牛血清和1%青霉素和鏈霉素的DMED培養基，37℃、5%CO2培養SKOV3-GFP和SKOV3-GFP/DDPⅡ細胞至對數生長期。以1×107個細胞的密度接種于裸鼠的腹股溝皮下，種植8 d后觀察成瘤情況。用游標卡尺測量腫瘤最長直徑（a）與最短直徑（b），待腫瘤體積（0.52×a×b2）長至400 mm3時，開始予隔日腹腔注射DDP（劑量為2.5 mg/kg，共8次），每組4只裸鼠。分別在第2次、第5次、第6次注射后的次日取出瘤塊，對照組分別為無順鉑處理的移植瘤。

1.2.2 qRT-PCR檢測Fas凋亡信號傳導通路上節點基因mRNA的表達以Trizol法提取所得腫瘤組織的RNA，定量后逆轉錄為cDNA。qRT-PCR檢測上述移植腫瘤組織cDNA中A2M、Fas凋亡信號轉導通路上節點基因mRNA的表達。所檢測基因的引物序列如表1，以GAPDH基因為內參。采用2-△△Gt法計算實驗組目的基因的表達相對于對照組的表達倍數。

表1 所測基因引物序列

1.2.3 A2M mRNA的表達與卵巢癌鉑類獲得性耐藥和患者預后的相關性分析利用TCGA數據庫中鉑類敏感和耐藥的卵巢癌患者的基因表達譜，分析A2M基因在鉑類敏感和耐藥患者中的表達差異；Pearson相關分析A2M mRNA的表達量與卵巢癌患者臨床耐藥以及預后（包括患者總生存期、無疾病進展生存期和化療間隔生存期）的相關性。

1.3 統計學分析

用SPSS 17.0統計學軟件進行分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間的比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），進一步兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。以Pearson相關分析A2M mRNA的表達量與卵巢癌患者鉑類耐藥以及預后的相關性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 A2M mRNA表達量與卵巢癌鉑類獲得性耐藥和患者預后的相關性分析

分析TCGA提供的89例卵巢癌鉑類耐藥患者和165例鉑類敏感患者的全基因組表達譜數據。結果表明相對于鉑類敏感病例，A2M mRNA在鉑類耐藥患者的表達下降（P＜0.05）（圖1）；Pearson相關分析發現A2M mRNA的表達與卵巢癌患者臨床耐藥相關（P=0.02），與卵巢癌患者總生存期、化療間隔生存期和無疾病進展生存期高度相關（P均＜0.001），其表達量越高，患者的生存期越長。

圖1 A2M m RNA在卵巢癌鉑類敏感和耐藥患者中的表達比較

2.2 qRT-PCR檢測A2M與Fas信號傳導通路上節點基因mRNA的表達

以qRT-PCR檢測與細胞凋亡密切相關的Fas信號傳導通路上的重要節點基因的mRNA表達。結果表明，A2M mRNA在卵巢癌鉑類敏感組織和耐藥組織中的表達隨順鉑注射次數的增多均呈現下降趨勢。未進行順鉑注射時，A2M mRNA在鉑類耐藥組織中的表達較鉑類敏感組織高2.0倍（P=0.001）。而經不同次數順鉑作用后，其在鉑類耐藥組織中的表達均低于鉑類敏感組織，尤其在順鉑注射2次后，A2M mRNA的表達下調了4.7倍（P=0.001）；至順鉑注射6次后，A2M mRNA的表達在鉑類敏感和耐藥移植瘤組織中均較低，但是在后者中的表達相對于前者仍顯著降低（P=0.045）。另外，隨順鉑注射次數的增加，Fas信號傳導通路上的Fas、FADD、caspase10、caspase9和caspase3在耐藥移植瘤組織中的mRNA表達相對于敏感移植瘤組織亦均明顯降低（P＜0.001），特別是在順鉑注射2次后，FasmRNA的表達下調了2.4倍（P=0.002），caspase9mRNA的表達下調了2.1倍（P=0.035），caspase3 mRNA的表達下調了2.1倍（P=0.043）；至順鉑注射6次后，FasmRNA的表達下調了3.7倍（P=0.001），FADD mRNA的表達下調了3.2倍（P=0.028），caspase10 mRNA和caspase9mRNA均下調2.0倍（P均=0.001）。而隨順鉑注射次數的增加，在Fas信號傳導通路下游與DNA修復相關的PARP1在耐藥移植瘤組織中的mRNA表達相對于敏感移植瘤組織明顯上調（P＜0.01），特別是順鉑注射6次后，上調了2.0倍（P=0.023）。各節點基因表達趨勢的變化見圖2。

圖2 qRT-PCR檢測A2M、Fas、FADD、caspase10、caspase9、caspase3和PARP1在裸鼠移植瘤中不同順鉑注射次數的m RNA相對表達量

2.3 A2M mRNA的表達與Fas信號傳導通路上節點基因以及下游基因表達的相關性分析

將不同次數順鉑作用后的腫瘤組織中A2MmRNA的相對表達量與Fas信號通路上節點基因和下游PARP1的相對表達量分別進行雙變量線性回歸分析，結果顯示A2MmRNA的表達變化與Fas信號傳導通路上節點基因和下游PARP1的表達變化均存在相關性（P＜0.05）。見圖3。

圖3 雙變量線性回歸分析A2M mRNA與Fas、FADD、caspase10、caspase9、caspase3和PARP1在裸鼠移植瘤中相對表達量的相關性

3 討論

在婦科腫瘤中卵巢癌發病隱匿，當腫瘤局限于卵巢時，僅約25%的患者可確診［2］。到腫瘤晚期（FIGO分期為Ⅲ期和Ⅳ期），當病變擴展至卵巢外部時，約70%的患者確診時已處于晚期，失去了最佳的治療時機。以鉑類藥物（順鉑、卡鉑、奧沙利鉑）為基礎結合紫杉醇類化療藥物的聯合化療是目前治療卵巢癌的一線化療方案［9］。盡管以順鉑治療卵巢癌初期表現較敏感［10］，但仍有15%～20%的患者出現原發性耐藥，而其余80%的患者雖然對鉑類敏感，但可能在反復化療過程中產生獲得性耐藥［11］。因此，深入探討卵巢癌的多藥耐藥機制，有利于了解疾病的發生、發展過程，以采取針對性的治療措施逆轉化療耐藥，改善卵巢癌患者的預后和提高生存質量。

本課題組在前期研究的基礎上，首先對A2M基因的表達與卵巢癌患者鉑類耐藥情況進行相關性分析。結果表明，相對于鉑類敏感病例，A2M基因在鉑類耐藥患者的表達下降，并與卵巢癌患者的鉑類耐藥以及總生存期、無疾病進展生存期和化療間隔生存期高度相關，其表達量越高，患者生存期越長。據此，我們初步認為A2M可能是與卵巢癌鉑類耐藥有關的重要因子，它可能維持卵巢癌患者對鉑類化療的敏感性。qRT-PCR檢測結果表明，在裸鼠移植瘤中A2M mRNA的表達隨順鉑注射次數的增多，相對于順鉑敏感組織，其在耐藥組織中的表達呈現下降趨勢。進一步比較發現，未進行順鉑注射時，A2M mRNA在耐藥組織中的表達高于敏感組織2.0倍，而經不同次數順鉑作用后，其在耐藥組織中的表達均低于敏感組織，特別是在順鉑注射2次后，A2M mRNA的表達顯著下降，至順鉑注射6次后，A2M mRNA的表達在敏感組織和耐藥組織中均很低，但相對于前者在后者中的表達仍表現出下調。以上結果提示A2M的表達隨藥物的作用出現了異常，從而更好地論證A2M可能與腫瘤細胞的鉑類耐藥有關這一推測。綜合A2M的表達與卵巢癌患者鉑類耐藥的相關性分析，我們進一步認定A2M可能是與卵巢癌鉑類耐藥相關的潛在信號分子，它在腫瘤細胞中的低表達減弱了細胞對鉑類藥物的敏感性。而對Fas凋亡信號傳導通路上節點各基因mRNA的表達進行qRT-PCR檢測，結果顯示Fas信號傳導通路在耐藥組織經順鉑作用后明顯被抑制，而與DNA修復相關的PARP1mRNA出現了表達上調。另外，Fas通路上的Fas、caspase10、caspase9和caspase3以及下游的PARP1未進行順鉑注射時，在敏感組織和耐藥組織中的mRNA表達無明顯差異，而Fas、caspase9 mRNA和caspase3 mRNA的表達均在第2次順鉑注射后出現大幅度地下降。這種潛在的聯系提示順鉑的干預可能是在改變了A2M的表達后影響Fas通路上節點基因mRNA的表達，繼之上調了其下游與DNA修復相關的PARP1基因的表達。而對A2M的表達變化與Fas信號傳導通路上節點基因和其下游基因的表達變化進行線性回歸分析，結果進一步證實了A2M的表達變化與Fas信號傳導通路存在一定聯系。

文獻報道，A2M作為血液中的一種大分子血漿蛋白，主要是通過抑制血液纖維蛋白溶酶和激肽釋放酶的活性來發揮抑制纖維蛋白溶解的功能，也可作為載體蛋白與許多生長因子和細胞因子，如血小板源生長因子、堿性成纖維細胞生長因子（TGF-β）、胰島素樣生長因子（IGF-1）和白細胞介素等結合［12］。Lauer等［13］認為A2M與生長因子結合，滅活了TGF-β1等已知的促腫瘤增殖因子，而抑制腫瘤生長和侵襲。Lillis等［14］證明A2M與其受體LRP1結合后能清除TGF-β1等其他生長調節配體。A2M和LRP1結合后還能吞噬多種基質金屬蛋白酶，如MMP-2等而抑制細胞遷移和侵襲［15］。據此，我們認為A2M可能是通過與LRP1結合而有助于機體自身免疫能力的維持，可促使鉑類藥物進入腫瘤細胞，通過Fas途徑誘導細胞凋亡，在一定程度上維持了腫瘤細胞對鉑類化療藥物的敏感性。在臨床上，卵巢癌患者由于長期進行化療，血漿中A2M下降后，其與LRP1的結合相對減弱，從而使Fas凋亡通路被抑制，細胞對藥物的敏感性減弱，導致細胞耐藥。本實驗研究也證實卵巢癌細胞耐藥時，A2M與Fas信號傳導通路上節點基因的表達均顯著下調，從而印證了以上推測。

綜上，我們推測A2M作為潛在的鉑類耐藥上游調控信號分子，直接或間接影響卵巢癌的腫瘤微環境，調控著微環境中某些細胞生長因子以及下游的葉酸代謝和凋亡信號通路，并能以某種方式激活細胞內Fas凋亡信號傳導通路，維持卵巢癌細胞對鉑類藥物的敏感性。在順鉑反復作用下，卵巢癌細胞中A2M基因的表達降低，通過與腫瘤微環境中某些細胞因子或趨化因子的相互作用，抑制了細胞內Fas凋亡信號傳導通路，使其調控下游的DNA修復功能增強，從而抵抗順鉑誘導的細胞凋亡，促進癌細胞增殖，使腫瘤細胞產生耐藥性。亦即A2M可能介導Fas信號傳導通路，從而提高卵巢癌患者對鉑類藥物的敏感性。但有關耐藥相關信號分子的表達異常后，具體是通過哪些細胞因子的協助以及如何與下游信號通路相互作用誘導了細胞對藥物的耐受，其機制仍需深入研究和證實。

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［2015-01-20收稿］［2015-03-09修回］［編輯阮萃才］

Association between A2M-induced Fas apop totic signaling and ovarian tumor sensitivity to p latinum-based chemotherapy

LIMengdi1，4，SHILijun1，4，LIU Hongmei1，4，YANG Zhijun2，3，PAN Zhongmian3，LILi2，3，WANG Qi1，2（1Research Department of Guangxi Cancer Institute；2Key Laboratory of High-Incidence-Tumor Prevention Treatment，Ministry of Education；3Department of Gynecological Oncology，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University；4Graduate School of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

WANG Qi.E-mail：qi_catcat@163.com

ObjectiveTo analyze the relationship of A2M-induced Fas signaling to drug resistance of ovarian cancer and to patient prognosis.M ethodsWe used gene expression profiles in the Cancer Genome Atlas to search for correlations of A2M expression with drug resistance of ovarian cancer and with patient prognosis based on Pearson correlation analysis.Cisplatin-sensitive or-resistant SKOV3 ovarian cancer cells expressing green fluorescent protein were inoculated subcutaneously into nude mice.At different timesafter cisplatin administration，tumor tissues were analyzed using real-time fluorescent quantitative PCR to determine expression of A2M and key node genes in the Fas pathway.Correlation between A2M expression and expression of node geneswas examined using linear regression.ResultsA2M correlates significantly with drug resistance of ovarian cancer（P=0.020）.A2M was expressed at significantly lower levels in platinum-resistant tissue than in platinum-sensitive tissue（P＜0.05），and higher A2M levels correlated significantly with longer platinum-free interval，overall survival，and progression-free survival（P＜0.001）.Platinum-resistant transplanted tumors expressed significantly lower levels of A2M and the apoptosis-related node genes Fas，FADD，Caspase10，Caspase9 and Caspase3 than did platinum-sensitive tumors（P＜0.001）.The downstream gene PARP1，important for DNA repair，was expressed at a significantly higher level in platinum-resistant tumors（P＜0.05）.Expression of A2M correlated linearly with that of node genes of the Fas signaling pathway（P＜0.05）.ConclusionsA2M may be amarker of cisplatin resistance in ovarian cancer.Lower levels of A2M expression may up-regulate expression of the DNA repair protein PARP1，inhibiting cell apoptosis and ultimately leading to cisplatin resistance.

Ovarian neoplasm；Cisplatin resistance；A2M；Fas signal transduction pathways；The cancer genome atlas

R737.31

A

1674-5671（2015）02-07

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.02.01

國家自然科學基金資助項目（81360341）;廣西自然科學基金資助項目（2013GXNSFAA019248）

王琪。E-mail：qi_catcat@163.com