m iR-144對肝癌細胞生物學功能的影響及其臨床意義

黃超源黃馨萍李先建朱繼業陳志剛黃山趙蔭農連芳鄔國斌

作者單位：530021南寧1廣西醫科大學附屬腫瘤醫院肝膽外科；2廣西醫科大學研究生學院；3廣西醫科大學生理學教研室

基礎研究

m iR-144對肝癌細胞生物學功能的影響及其臨床意義

黃超源1，2黃馨萍1李先建1朱繼業1陳志剛1黃山1趙蔭農1連芳3鄔國斌1

作者單位：530021南寧1廣西醫科大學附屬腫瘤醫院肝膽外科；2廣西醫科大學研究生學院；3廣西醫科大學生理學教研室

目的探討miR-144在肝癌組織中的表達水平及其對肝癌細胞生物學功能的影響，并分析其臨床意義。方法通過qRT-PCR法檢測肝癌及其癌旁組織中miR-144的表達，以瞬時轉染建立人肝癌細胞過表達miR-144模型，采用CCK-8和細胞克隆形成實驗檢測轉染后肝癌細胞的增殖和細胞克隆形成能力，采用流式細胞術、Transwell法檢測肝癌細胞的細胞周期和遷移能力，分析miR-144的表達水平對肝癌細胞生物學功能的影響及其與臨床病理特征的關系。結果miR-144在肝癌組織中的表達明顯低于癌旁組織（P＜0.05）；與未處理及陰性對照的肝癌細胞相比，過表達的miR-144均能有效抑制肝癌細胞的增殖、細胞克隆形成及遷移能力（P均＜0.05），并誘導細胞周期阻滯在S期（P＜0.05）；miR-144高表達組的肝癌患者術后生存時間長于低表達組（P＜0.05），miR-144的表達與患者性別、年齡、乙肝病毒感染、腫瘤大小、腫瘤個數、AFP、臨床分期等臨床病理特征無明顯相關（P均＞0.05）。結論miR-144在肝癌組織中低表達且與預后相關，過表達的miR-144能夠抑制肝癌細胞的增殖和遷移。

肝腫瘤；miR-144；增殖；遷移；預后

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，簡稱肝癌）是全球第五大惡性腫瘤，在癌癥死因中位居第三位［1］。肝癌的發生是一個復雜的多步驟漸進過程，涉及很多信號因子的改變，從而構成一個紛繁復雜的分子譜［2，3］。目前對肝癌的發病機制仍不明了。microRNAs（簡稱miRNAs）是一類長約22個堿基的內源性非編碼RNA，通過靶向mRNA的3′非編碼區域（3′untranslated region，3′UTR）來降解靶基因的mRNA或抑制其翻譯，作為多靶基因的轉錄后負調控作用。研究證實miRNAs可作為癌基因或抑癌基因廣泛參與多種腫瘤（包括肝癌）的生物學過程，如細胞增殖、凋亡和轉移等［4～7］。因此，對異常表達miRNAs的研究將有助于揭示肝癌發生、發展的機制，以及探尋肝癌新的治療靶點。

研究發現，miR-144在多種腫瘤中的表達下調，并參與腫瘤細胞的多個生物學過程，如在甲狀腺癌中，miR-144的表達下調促進了癌細胞的侵襲［8］；miR-144通過靶向EZH2和調控Wnt信號傳導通路抑制膀胱癌細胞的增殖［9］；恢復miR-144的表達則抑制非小細胞肺癌細胞的增殖及誘導其凋亡［10］。我們前期進行的高通量大規模測序研究發現miR-144在肝癌組織中低表達［11］，本研究旨在進一步驗證miR-144在肝癌細胞及組織中的表達水平，分析miR-144的表達與臨床病理、預后的關系，并探討其在肝癌細胞中的生物學功能及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料及組織標本組織標本源于2011年 3月至2013年5月在廣西醫科大學附屬腫瘤醫院肝膽外科行手術根治性切除的51例肝癌患者，其中男性44例，女性7例，平均年齡46歲。收集每例患者術后的肝癌組織及其癌旁組織，迅速置于液氮中保存。術前所有患者未經化療、放療及靶向治療，術后病理檢查均診斷為肝癌。對所有患者進行隨訪，中位隨訪時間為12個月。本研究征得每位患者的知情同意，且經本院醫學倫理委員會批準。

1.1.2 細胞系人肝癌細胞系QGY-7703、SK-hep1及正常肝細胞HL-7702均源于上海生命科學院細胞庫，由本實驗室傳代、保存。

1.1.3 主要試劑和儀器RPMI 1640（Gibco）、胎牛血清（F月S，Gibco）、TRIzol（Invitrogen）均購自美國Life公司；CCK-8購自日本同仁化學公司；miR-144模擬物及陰性對照（NC）模擬物由上海吉瑪生物公司合成；所有引物由上海英駿生物公司合成；miRNA逆轉錄試劑盒ReverTra Ace-α-及熒光定量PCR試劑盒Thunderbird Sybr qPCRMix購自日本Toyobo公司；轉染試劑Interferin購自法國Polyplus-transfection公司；細胞周期試劑盒購自凱基公司；Transwell小室購自美國Corning公司。熒光定量PCR儀MxPro-Mx3000P Sequence Detection System購自美國Stratagene公司；流式細胞術儀購自美國月eckman Coulter公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養和轉染人肝癌細胞系QGY-7703、SK-hep1在含10%胎牛血清的RPMI 1640中置于37℃、5%CO2的培養箱培養。細胞鋪板、培養過夜后，用轉染試劑Interferin將miR-144及NC模擬物轉入肝癌細胞系QGY-7703、SK-hep1中，模擬物終濃度為100μmol/L。

1.2.2 細胞、組織逆轉錄及熒光定量PCR（qRT-PCR）

總RNA用TRIzol試劑進行抽提。采用第一鏈cDNA逆轉錄試劑盒ReverTra Ace-α-進行miRNA逆轉錄，用Thunderbird Sybr qPCR Mix試劑盒進行熒光定量qRT-PCR反應，以上實驗均按試劑盒說明書操作。miR-144特異性逆轉錄引物為5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGTACA-3′；miR-144 qRT-PCR引物為5′-GGGAGATCAGAAGGTGATT-3′，下游引物為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；內參U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應條件為95℃預變性1 min，之后95℃15 s，58℃15 s，72℃45 s，40個循環后檢測溶解曲線。反應結束后用MxPro Mx3000PSequence檢測系統進行分析。

1.2.3 細胞增殖、細胞克隆形成實驗將肝癌細胞以5×103個/孔接種于96孔板中培養過夜，更換培養基后轉染miR-144及NC模擬物，每組設5個復孔，于0 h、24 h、48 h、72 h后分別加入10μl CCK-8，在細胞培養箱孵育2 h后，用酶標儀檢測吸光度，根據吸光度值繪制肝癌細胞增殖曲線。將肝癌細胞以1×103個/孔接種于6孔板中培養過夜，更換培養基后轉染miR-144及NC模擬物，每組設3個復孔，培養10 d后，用4%的多聚甲醛固定30min，然后用1%的結晶紫染色，拍照并計數細胞克隆形成數（50個細胞/克?。?。

1.2.4 細胞周期實驗轉染miR-144及NC模擬物48 h后收集細胞，用預冷的P月S洗滌1次，用70%的乙醇于4℃固定過夜，離心去除乙醇后，用P月S洗滌2次，加100μl RNase A 37℃水浴30 min，再加入400μl PI染色，4℃避光30 min，最后用流式細胞術檢測細胞周期。重復實驗3次。

1.2.5 細胞遷移實驗細胞轉染24 h后計數，將5×104個細胞重懸于200μl無血清培養基中，并置于Transwell上室中，下室加入600μl含10%F月S的RPMI 1640培養基。在細胞培養箱中孵育24 h，取出上室后用棉簽輕輕擦去上室內部細胞，固定、染色，風干后置于倒置顯微鏡下拍照、計數。

1.3 統計學分析

采用SPSS 16.0統計學軟件分析、處理實驗數據。計量資料用均數±標準差（±s）表示，樣本間miR-144的表達分析采用配對t檢驗；miR-144的表達與臨床病理特征關系采用χ2檢驗及Fisher確切概率法；術后生存期采用Kaplan-Meier法及log-rank檢驗分析；多組比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-144在肝癌組織中的表達

為了驗證本課題組前期的高通量大規模測序結果，本研究通過qRT-PCR方法檢測51例肝癌患者的癌組織及其癌旁組織miR-144的表達水平。結果顯示，92.16%（47/51）的肝癌組織中miR-144呈低表達，miR-144在肝癌組織中的表達水平顯著低于癌旁組織（P＜0.05）（圖1A）。此外，根據miR-144在肝癌組織中表達量的中位數，將51例肝癌患者分成兩組，分別為高表達組26例，低表達組25例。分析發現，miR-144的低表達與肝癌患者更短的術后生存時間顯著相關（P＜0.05）（圖1月）。miR-144的表達量與患者性別、年齡、乙肝病毒感染、腫瘤大小、腫瘤個數、AFP、臨床分期等臨床病理特征無明顯相關（P均＞0.05）。見表1。為了驗證miR-144的轉染效率，我們對轉染模擬物后的miR-144組、NC組及未處理組進行qRT-PCR驗證。結果顯示，QGY-7703和SK-hep1的miR-144表達水平高于其他兩組。見圖1C。

2.2 miR-144對肝癌細胞增殖和細胞克隆形成的影響

CCK-8法檢測轉染miR-144及NC模擬物后肝癌細胞的增殖能力。結果顯示，在轉染48 h后，與NC組及未處理組相比較，miR-144組QGY-7703及SK-hep1細胞的增殖能力明顯受抑制（P＜0.05）；轉染72 h后，對肝癌細胞的抑制作用最為明顯（P＜0.05）（圖2A）。細胞克隆形成能力檢測結果如圖2月所示，在轉染10 d后，QGY-7703及SK-hep1細胞的miR-144組細胞克隆團數明顯少于NC組及未處理組（P＜0.05）。

2.3 miR-144對肝癌細胞細胞周期的影響

為了驗證過表達的miR-144是否通過抑制細胞周期影響肝癌細胞的增殖，通過流式細胞術檢測轉染miR-144模擬物48 h后的肝癌細胞細胞周期。結果顯示，與NC組及未處理組相比較，miR-144組肝癌細胞的S期明顯增多，miR-144組、NC組及未處理組S期的細胞百分比在QGY-7703細胞中分別為（26.95±0.66）%、（19.02±0.1）%、（22.11±0.54）%（P＜0.05）；SK-hep1肝癌細胞分別為（25.52±0.08）%、（21.02±2.26）%、（20.66±0.19）%（P＜0.05）。說明過表達miR-144可以使肝癌細胞細胞周期阻滯在S期，從而抑制肝癌細胞的增殖。見圖3。

2.4 miR-144對肝癌細胞遷移的影響

miR-144模擬物轉染肝癌細胞48 h后，Transwell實驗結果顯示，QGY-7703及SK-hep1細胞miR-144組的細胞穿膜數均明顯少于NC組及未處理組（P＜0.05）。說明過表達的miR-144可以抑制肝癌細胞的遷移能力。見圖4。

圖1 m iR-144在肝癌組織中的表達及其與預后的相關性和轉染后的qRT-PCR驗證

圖2 轉染m iR-144對肝癌細胞增殖及細胞克隆形成的影響

圖3 轉染m iR-144模擬物對肝癌細胞細胞周期的影響

表1 m iR-144的表達與肝癌患者臨床病理特征的關系［n（%）］

圖4 轉染m iR-144模擬物對肝癌細胞遷移能力的影響

3 討論

近年研究表明，miRNAs不僅參與人體正常的生理過程，而且其異常表達在腫瘤發生、發展、診斷和預后中扮演非常重要的角色，幾乎參與腫瘤所有的生物學過程，包括細胞增殖、凋亡、遷移和血管生成等。因此，miRNAs受到學者們越來越多的關注，被視為一種潛在的腫瘤診斷和治療工具［12］。本研究中，miR-144在肝癌組織中普遍低表達，而且與患者預后相關，提示其有可能作為一個潛在的生存指標。同時體外實驗發現，miR-144具有抑癌因子的生物學功能，可以抑制肝癌細胞的生長和遷移。

miR-144在多種腫瘤中低表達，并發揮抑癌基因的作用。Navon等［13］使用新的基于秩和統計學方法，分析來源于8種不同組織（乳腺、結腸、肝、肺、淋巴、卵巢、前列腺、睪丸）的癌及其癌旁組織32個miRNAs芯片（miRNAs數量超過700個），結果發現一些miRNAs在多數腫瘤中的表達趨勢一致，其中miR-144在這8種腫瘤中普遍低表達，提示其可能具有抑癌功能。Guan等［8］研究miR-144在甲狀腺癌中的作用，發現過表達的miR-144可以靶向ZE月1和ZE月2抑制甲狀腺癌細胞的侵襲。Zhang等［14］發現PAX4可以下調miR-144/451，miR-144/451下調后失去對解聚素金屬蛋白酶（ADAM）家族ADAMTS5和ADAM10的抑制作用，進而促進乳腺癌及頭頸鱗狀細胞癌的轉移。其他研究則證實miR-144可以直接靶向X染色體鋅指蛋白（ZFX），不僅可以抑制非小細胞肺癌細胞的生長，誘導其凋亡［10］，還可以提高胃癌細胞對5-氟尿嘧啶的敏感性［15］。但也有研究發現miR-144在其他癌組織中呈高表達，并且具有促癌基因的作用［16］，這可能與miRNAs的組織特異性相關。本研究發現，miR-144在肝癌組織中普遍低表達，恢復miR-144的表達后能明顯抑制肝癌細胞的增殖、細胞克隆形成及遷移能力，這與之前的報道一致［17，18］。本實驗還發現，miR-144能夠阻滯肝癌細胞周期于S期，這與王錚等［18］的研究不同，他們認為miR-144對細胞周期無明顯影響，其原因可能與轉染載體或實驗條件有關。

miRNAs不僅可參與腫瘤的發生、發展，而且還可以作為一種潛在的分子標志物應用于臨床，如在肺癌［19］、胃癌［20］、肝癌［21］和白血?。?2］中的研究表明，特異性差異表達的miRNAs與腫瘤患者的臨床病理及預后相關。據文獻報道，miR-144在胃癌［15］、結直腸癌［23］、頭頸鱗狀細胞癌［14］中呈低表達，低表達的miR-144提示患者預后較差，同時低表達的miR-144在結直腸癌患者中提示有更多的血管侵犯、肝轉移和更高的術后復發率［23］。本實驗分析51例肝癌患者臨床病理及術后生存時間與miR-144表達水平的關系，發現肝癌組織miR-144的高低表達在腫瘤大小、腫瘤個數、AFP、臨床分期等臨床病理中無顯著差異，而miR-144的表達水平則與患者術后生存期明顯相關（P＜0.05），miR-144低表達者其預后較差。

雖然miR-144作為一種抑癌基因在多種腫瘤中呈低表達，但至今其機制仍不清楚。miR-144（Gene ID：406936）與miR-451（Gene ID：574411）均定位于人類染色體17q11.2，miR-144位于miR-451上游100 bp處，作為同一個基因簇，miR-144/451在某些疾病的表達和調控方面具有一致性［14，24，25］。研究發現，miR-451在肝癌組織中低表達，恢復其表達后可以靶向IKK-β抑制肝癌細胞的增殖［26］，或者調控轉錄激活因子2（ATF2）抑制肝癌細胞遷移［27］。這些證據說明，miR-144/451在某些組織中下調的機制可能相同。其中一種可能的機制是表觀遺傳。Wang等［28］試圖探討miR-451在非小細胞肺癌細胞中下調是否與DNA甲基化和（或）組蛋白脫乙?；嚓P，當用5-氮-2′-脫氧胞苷、苯丁酸鈉及兩者聯合處理非小細胞肺癌細胞后，發現miR-451的表達分別提高2.5倍、4.2倍和6.4倍，說明表觀遺傳可能直接或間接參與了miR-451的下調；而Li等［26］的研究發現，內源性抑癌基因E2a可以通過靶向E盒轉錄激活miR-451的啟動子，提示抑癌基因對miR-144/451上游的調控也許是另外一種機制；基因組中miR-144/451所在位點的缺失或突變是否為其異常表達的原因，目前尚未見相關報道。因此有關方面仍需進一步研究。

綜上，miR-144在肝癌組織中低表達與患者預后相關，過表達miR-144能夠抑制肝癌細胞的增殖、遷移。但由于miRNAs能夠調控多個靶點發揮作用，因此有關miR-144下調及其調控的機制，亟待更深入地研究。

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［2015-02-01收稿］［2015-03-20修回］［編輯阮萃才］

Exp ression and clinical significance of m iR-144 and its im pact of biological function in hepatocellu lar carcinom a

HUANG Chaoyuan1，2，HUANG Xinping1，LI Xianjian1，ZHU Jiye1，CHEN Zhigang1，HUANG Shan1，ZHAO Yinnong1，LIAN Fang3，WU Guobin1（1Department of Hepatobiliary Surgery，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University；2Graduate School of Guangxi Medical University；3Department of Pathophysiology，GuangxiMedical University，Nanning 530021，P.R.China）

WU Guobin.E-mail：gb.wu@139.com

Liver neoplasm；miR-144；Proliferation；Migration；Prognosis

R735.7

A

1674-5671（2015）02-07

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.02.02

國家自然科學基金資助項目（81360315）；廣西衛生廳自籌經費科研課題（Z2011228）

鄔國斌。E-mail：gb.wu@139.com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression ofmiR-144 in hepatocellular carcinoma（HCC）tissue and its relationship with clinicopathological factors，aswell as its function in cells.M ethodsExpression ofmiR-144 in HCC and adjacent noncancerous tissue from patientswas quantitated using qRT-PCR，and levelswere compared with clinicopathological factors to identify possible correlations. Mimics ofmiR-144 and a negative control（NC）sequencewere transfected into human HCC cell lines，which were analyzed in terms of proliferation（CCK-8 assay），colony formation and migration（transwell assay）as well as cell cycle（flow cytometry）.ResultsExpression ofmiR-144 was significantly lower in HCC samples than inmatched controls（P＜0.05）.Overexpression ofmiR-144 in HCC cell lines，but not the non-treated or the NC sequence，significantly reduced proliferation，colony formation and migration（P＜0.05），as well as arrested the cell cycle in S phase.Postoperative survival was longer in HCC patients showing high miR-144 expression than in those showing low expression（P＜0.05）.Other clinicopathological factors，however，did not correlate with miR-144 expression，including tumor size or number，AFP（P＞0.05）.ConclusionFrequently downregulated in HCC tissues，miR-144 acts as a tumor suppressor and may serve as a prognostic factor.