廣西扶綏地區乙型肝炎病毒基因型分布的概況

李召發鄧偉黃天壬李曦亮鄭丹

作者單位：530021南寧1廣西腫瘤防治研究所實驗研究部；2廣西醫科大學研究生學院

流行病學調查

廣西扶綏地區乙型肝炎病毒基因型分布的概況

李召發1，2鄧偉1黃天壬1李曦亮1，2鄭丹1，2

作者單位：530021南寧1廣西腫瘤防治研究所實驗研究部；2廣西醫科大學研究生學院

目的研究廣西扶綏地區乙型肝炎（簡稱乙肝）患者H月V基因型分布特點，為本地區乙肝的防治及臨床抗乙肝感染的治療提供依據。方法采用巢式PCR技術對285例（肝癌40例，乙肝病毒攜帶者245例）擴增H月V S區基因，經測序后與標準序列比對，得出相應的基因型，分析H月V基因型的分布概況及其特點。結果在285例患者中，月基因型59例（20.7%），C基因型223例（78.2%），未分型3例（1.1%）。在肝癌和乙肝病毒攜帶者中，月基因型、C基因型分別為10例（25.00%）、30例（75.00%）和49例（20.25%）、193例（79.75%）（P＞0.05）；男性月基因型、C基因型分別為40例、158例，女性月基因型、C基因型分別為19例、65例，H月V基因型在男性和女性間的分布差異均無統計學意義（P均＞0.05）；在＜30歲、30～40歲、40～55歲、＞55歲各年齡組間H月V基因型的分布差異均無統計學意義（P均＞0.05）。結論扶綏地區H月V基因型以C基因型占主要優勢，其次是月基因型，未見其他分型；H月V基因型在年齡、性別間的分布無明顯差異。

肝腫瘤；乙型肝炎病毒；基因型；分布

乙型肝炎病毒基因型和基因亞型的分布具有明顯的地域和人種差異，以往研究表明，我國乙型肝炎（簡稱乙肝）主要以H月V月基因型和C基因型感染為主，其基因亞型也呈現一定的地域分布。廣西是乙肝高發地區，目前發病狀況仍未得到有效控制。對廣西扶綏地區乙肝病毒基因型的分布尚無文獻報道。H月V基因型可能與病毒感染途徑、基因突變、疾病進程和抗病毒療效有一定關系，故研究基因型的分布情況及其特點，可為肝癌高發區H月V感染提供有益資料以及為H月V相關肝癌的病因學研究提供依據。本實驗研究廣西扶綏地區乙肝病毒基因型的分布概況及其特點?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源

對廣西扶綏地區肝癌高危人群進行調查研究，通過血清采集及處理，最終篩選285例研究對象（H月V DNA病毒拷貝數≥103），其中肝癌患者40例，臨床無癥狀的乙肝病毒攜帶者245例。肝癌病例的診斷符合2001年中國抗癌協會肝癌專業委員會修訂的《原發性肝癌的臨床診斷與分期標準》，乙肝病毒攜帶者為乙型肝炎病毒表面抗原陽性者。研究對象的血清經分離后置-80℃冰箱保存備用。

1.2 血清H月V DNA復制水平的檢測

采用PCR-熒光探針法（乙型肝炎病毒核酸定量測定試劑盒為湖南圣湘生物科技有限公司產品）檢測H月V DNA復制水平，檢測步驟參照試劑說明書，將50 ml血清樣本與5μl核酸釋放劑充分混勻后作為PCR反應的模板，加入40μl PCR-mix，2 000 r/min離心30 s，最后進行PCR擴增。檢測下限值為500拷貝/ml。

1.3 H月V DNA的提取和擴增

從患者血清中提取DNA（北京天根PD315試劑盒），操作步驟按照說明書進行，取研究對象血清200μl H月V DNA，溶解于30μl ddH2O中。采用巢式PCR擴增H月V S區基因。第一輪擴增引物為Fgp1和Rgp2，第二輪擴增引物為Fgp3和Rgp4。S區PCR第一輪反應條件為95℃2 min；95℃35 s，58℃30 s，72℃60 s，30個循環；72℃10 min。第二輪反應條件為95℃2 min；95℃35 s，60℃30 s，72℃60 s，30個循環；72℃10min。引物序列見表1。

表1 HBV S區的巢式PCR擴增引物

1.4 基因測序及基因型分析

所有PCR產物經2.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，交由北京六合華大基因科技股份有限公司廣州分公司進行測序，并經A月I3730xl基因分析儀進行雙向測序。對返回的測序結果用Chromas Pro 1.21軟件進行分析，序列比對用DNAMAN 7.0。測序后得到的前S基因序列，采用NC月I的在線病毒基因分型工具確定H月V基因型。

1.5 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行分析。計數資料采用百分率表示，各組資料間兩兩比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 H月V基因型的分型

285例患者H月V基因型分型中，月基因型59例（20.7%），C基因型223例（78.2%），未分型3例（1.1%）。提示扶綏地區C基因型較月基因型的分布占優勢。

2.2 H月V基因型在肝癌及乙肝病毒攜帶者之間的分布

在40例肝癌患者中，月基因型10例（25.00%），C基因型30例（75.00%）；在乙肝病毒攜帶者中，月基因型49例（20.25%），C基因型193例（79.75%）。提示在肝癌和乙肝病毒攜帶者中，C基因型較月基因型占優勢，但兩組H月V基因型的分布差異無統計學意義（χ2=0.47，P＞0.05）。

2.3 H月V基因型在男性、女性間的分布

經統計分析，在男性、女性中月基因型和C基因型的分布分別為40例、158例和19例、65例，二者比較差異均無統計學意義（P均＞0.05）。即H月V基因型在男性、女性間的分布未見明顯差異。

2.4 H月V基因型在各年齡組間的分布

經統計分析，月基因型者平均年齡51歲，C基因型者平均年齡49歲。在各年齡組間H月V基因型的分布差異均無統計學意義（P均＞0.05）。見表2。

表2 HBV基因型在各年齡組間分布的比較［n（%）］

3 討論

慢性乙型病毒性肝炎是嚴重危害人類身體健康的傳染病，呈全球廣泛分布。根據H月V全基因組序列差異程度，以8%的序列差異為分型標準。我國目前將H月V分為A～H 9種基因型，H月V基因型具有地域分布的特異性［1］。而不同基因型H月V的復制能力和逃逸宿主免疫壓力的能力不同，從而導致不同地區H月V感染率和基因型分布呈一定的地理流行病學特征［2～4］，故對H月V基因型流行病學的研究具有重要意義。

H月V基因型的差異將導致H月V感染者臨床表現、預后、抗病毒療效的差異。有研究表明，這些疾病譜的不同除了與感染者年齡、機體免疫力、H月V DNA載量有關外，還與H月V基因型有關。研究表明，H月V基因型中在以月基因型、C基因型為主的亞洲地區，C基因型患者肝炎與肝纖維化程度較月基因型者嚴重，C基因型與嚴重的肝病有關，是慢性H月V感染向肝硬化、肝癌進展的危險因素［5～7］。本研究顯示扶綏地區C基因型在所有H月V基因型中占優勢，與上述研究結果相符。

免疫治療是目前治療肝癌的重要研究方向，已有多種治療方法應用于臨床，并取得了一定的療效［8］。研究不同地區H月V基因型的分布及其特點，可為肝癌的免疫治療提供分子水平的理論依據。

研究表明，中國北方H月V基因型以C基因型為主，南方則以月基因型為主［9］。月基因型患病年齡較小，而C基因型患病年齡較大。本研究結果顯示，C基因型患病平均年齡較月基因型偏小，這可能與地區和種族差異以及樣本量大小有關。本研究對廣西扶綏地區乙肝病毒基因型分布情況及其在不同年齡、性別的差異進行分析，結果發現在廣西扶綏地區285例患者中，H月V基因型中月基因型與C基因型的構成比分別為20.7%及78.2%，與前期文獻［9］報道不符，分析認為可能與扶綏地區基因型分布的個性特征及樣本來源、樣本量大小等因素有關。因此必須通過多中心和擴大樣本量進行更深入地研究，以進一步了解我國H月V基因型的分布概況，這對乙型肝炎的防治有重要意義。本研究顯示，H月V基因型在男性、女性間及各年齡組間的分布均無明顯差異，提示性別及年齡對廣西扶綏地區H月V基因型的分布沒有明顯影響。加強H月V基因型的檢測，了解本地區乙肝患者基因型的分布及其特點，將對乙型肝炎的防治及臨床抗乙肝感染治療提供可靠的實驗依據。有關方面有待深入研究。

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［2015-01-03收稿］［2015-01-25修回］［編輯阮萃才］

Distribution of hepatitis B virus genotypes in the Fusui regional of Guangxi，China

LI Zhaofa1，2，DENG Wei1，HUANG Tianren1，LIXiliang1，2，ZHENG Dan1，2（1Research Department of Guangxi Cancer Institute，2Graduate School of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

HUANG Tianren.E-mail：tianrenhuang@sina.com

ObjectiveTo study the genotype distribution of hepatitis月virus（H月V）in patients from the Fusuiarea of China in order to guide prevention and treatment efforts.M ethodsA total of 40 patientswith liver cancer and 245 H月V carrierswere analyzed using nested PCR to amplify the H月V S region.The amplicons were sequenced and analyzed in sequence alignments with published H月V genotypes.ResultOf the 285 participants，59（20.7%）were infected with genotype月virus，223（78.2%）with genotype C，and 3（1.1%）with an undefined genotype.Of the 282 participantswith either genotype月or C virus，men accounted for 40 with genotype月and 158 with genotype C；women accounted for 19 with genotype月and 65 with genotype C.The gender distribution was similar for these two genotypes（P＞0.05）.Among liver cancer patients，10（25%）had genotype月and 30（75%）had genotype C；among H月V carriers，49（20.25%）had genotype月and 193（79.75%）had genotype C.Stratification of patients into four age groups（＜30 years，30-40 years，40-55 years，and＞55 years），The distribution of these two genotypes was similar in the four age groups（P＞0.05）.ConclusionH月V genotype C predominates in the Fusui area，followed by genotype月，with no other types observed.Genotypes月and C are distributed similarly among individuals of different age and gender.

Liver neoplasm；Hepatitis月virus；Genotype；Distribution

R373.2+1

A

1674-5671（2015）02-03

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.02.10

國家自然科學基金資助項目（30960333；81260319），廣西高?？蒲谢鹳Y助項目（2013ZD016）

黃天壬。E-mail：tianrenhuang@sina.com