索拉非尼聯合斑蝥酸鈉對肝癌HepG2細胞的抑制作用

陳志剛魯號峰朱繼業黃山鄔國斌黎樂群趙蔭農

作者單位：530021南寧1廣西醫科大學附屬腫瘤醫院肝膽外科；2廣西醫科大學研究生學院

基礎研究

索拉非尼聯合斑蝥酸鈉對肝癌HepG2細胞的抑制作用

陳志剛1，2魯號峰1，2朱繼業1，2黃山1鄔國斌1黎樂群1趙蔭農1

作者單位：530021南寧1廣西醫科大學附屬腫瘤醫院肝膽外科；2廣西醫科大學研究生學院

目的探討索拉非尼聯合斑蝥酸鈉對肝癌HepG2細胞的抑制作用及相關機制。方法將不同濃度的索拉非尼和斑蝥酸鈉分為索拉非尼組、斑蝥酸鈉組及索拉非尼+斑蝥酸鈉聯合用藥組（聯合用藥組），并設空白對照組，分別作用于肝癌HepG2細胞。CCK-8法測定兩個單藥組及聯合用藥組對肝癌HepG2細胞的抑制作用，流式細胞術檢測細胞周期，Western blot法檢測ERK及pERK蛋白的表達水平。結果索拉非尼組、斑蝥酸鈉組及聯合用藥組均可抑制肝癌HepG2細胞的增殖，并具有劑量-時間依賴效應，聯合用藥組細胞抑制率高于兩個單藥組（P均＜0.05）。索拉非尼濃度為4μmol/L、斑蝥酸鈉濃度為3.88μmol/L聯合用藥的48 h時段表現為協同作用，其余大多表現為相加作用。3組G1期細胞百分比均明顯高于對照組（P均＜0.001），聯合用藥組較兩個單藥組更高（P＜0.05）；兩個單藥組及聯合用藥組的ERK蛋白的表達較對照組無明顯差異（P=0.1），索拉非尼組及聯合用藥組pERK蛋白的表達明顯低于對照組的（P＜0.05），斑蝥酸鈉組明顯高于對照組（P=0.023）。結論索拉非尼和斑蝥酸鈉對肝癌HepG2細胞均有抑制增殖的作用，聯合用藥表現為協同或相加作用，其機制可能與阻滯細胞周期及抑制RAF/MEK/ERK信號傳導通路有關。

肝腫瘤；索拉非尼；斑蝥酸鈉；抑制作用；信號傳導通路

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細胞株HepG2購自中國科學院上海細胞庫。斑蝥酸鈉（批號：130906）購于貴州神奇制藥有限公司，CCK-8購于日本同仁化學研究所，多聚甲醛及吉姆薩染色劑購于武漢博士德生物工程有限公司。周期試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司，索拉非尼（批號：08705s000109252013）、ERK1/2及pERK1/2蛋白抗體購自美國Cell Signaling Technology生物公司。

1.2 細胞培養

將肝癌細胞株HepG2置于含12%胎牛血清及100 U/ml青鏈霉素的1640培養液中于37℃、5%CO2恒溫箱中培養。每2 d用0.05%胰蛋白酶進行消化傳代一次。

1.3 CCK-8法檢測肝癌HepG2細胞的增殖抑制情況

將處于對數生長期的細胞消化、離心制成單細胞懸液并接種于96孔板，按每孔10 000個細胞將HepG2細胞接種于96孔板，取索拉非尼濃度為1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L、32μmol/L；斑蝥酸鈉濃度為0.97μmol/L、1.94μmol/L、3.88μmol/L、7.76μmol/L、15.52μmol/L、31.04μmol/L分別作用于HepG2細胞48 h，然后加入CCK-8試劑，每孔10μl，37℃避光孵育1 h后用酶標儀在450 nm處測定各孔吸光度值（OD值）。根據測得的OD值計算抑制率。抑制率（%）=（對照組OD值-實驗組OD值）/對照組OD值×100%，計算50%細胞生長抑制所需的各藥物濃度（IC50），以確定后續藥物濃度。根據索拉非尼及斑蝥酸鈉單藥IC50值設定聯合用藥的濃度。依據上述實驗計算得IC50索拉非尼=5.703μmol/L，IC50斑蝥酸鈉= 4.507μmol/L，以此確定本實驗索拉非尼組濃度為2μmol/L、4μmol/L、6μmol/L、8μmol/L；斑蝥酸鈉組濃度為1.94μmol/L、3.88μmol/L、5.82μmol/L、7.76μmol/L，聯合用藥組藥物濃度分別為以上索拉非尼組和斑蝥酸鈉組各個濃度之和，每組設6個復孔，設不含藥物對照組。分別培養24 h、48 h及72 h。采用協同作用q值判斷索拉非尼和斑蝥酸鈉聯合作用的性質。q=Eab/（Ea+Eb-Ea×Eb），式中Ea和Eb為各單藥組抑制率，Eab為聯合用藥組抑制率。當q＞1.15時，認為兩藥有協同作用；0.85≤q≤1.15則為相加作用；q＜0.85為兩藥聯合表現為拮抗作用。以獲得最佳協同作用q值的聯合藥物濃度進行細胞周期檢測及Western blot實驗。

1.4 流式細胞術檢測肝癌HepG2細胞的細胞周期

取對數生長期細胞懸液接種于6孔板，每孔細胞數為5×104個，24 h后加入藥物。培養24 h后分別消化、離心，70%酒精固定過夜后，P月S洗滌3次，加入RNAse A及PI，常溫避光染色30 min后以流式細胞術儀檢測細胞周期。

在借鑒Jackson E L、Crawford D W和Godbey G等休閑制約理論模型基礎上，學者Walker GJ和Virden R J針對戶外游憩活動提出了戶外游憩制約因素模型 (圖5)。整個模型是一個循環反饋的過程。尤其是該模型新增加了先行宏觀因素 (包括種族、性別、文化等)和先行微觀因素 (包括個性、需求、態度和信仰等)［2］240－243和環境條件3個變量。模型中有利于休閑行為實現的環境條件受到微觀因素和宏觀因素的共同影響。休閑制約協商則受到微觀因素和環境條件的共同影響。而環境條件影響休閑偏好、休閑參與決策和實際參與行為。

1.5 Western blot法檢測肝癌HepG2細胞ERK、pERK蛋白的表達

加藥24 h后提取蛋白，測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液，100℃煮沸5min后于-80℃冰箱保存備用。配置SDS-PAGE凝膠，每孔加入蛋白20μg，接通電源常規電泳、切膠、轉膜、月SA封閉。T月ST洗膜3次，孵育一抗（1∶1 000）、4℃過夜，洗膜、孵育二抗1 h后滴加發光液上機掃膜并分析結果。

1.6 統計學方法

采用SPSS 16.0統計學軟件進行數據分析。實驗結果以均數±標準差（±s）表示，組間及不同時間點間的比較采用方差分析，多重比較時則采用LSD檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 索拉非尼組、斑蝥酸鈉組及聯合用藥組對肝癌HepG2細胞生長抑制的影響

CCK-8法檢測結果顯示，索拉非尼組和斑蝥酸鈉組及聯合用藥組對肝癌HepG2細胞的抑制率均隨濃度的增加及時間延長而增加，呈劑量-時間依賴效應，而聯合用藥組抑制作用則較兩個單藥組更明顯，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。見表1。當索拉非尼濃度為4μmol/L、斑蝥酸鈉濃度為3.88μmol/L時q值在各時段內均為最大，其中48 h段的q值為1.179（q＞1.15），表現為協同作用，而其余大多表現為相加作用。見表2。

2.2 索拉非尼組、斑蝥酸鈉組及聯合用藥組對肝癌HepG2細胞細胞周期的影響

在G0/G1期，索拉非尼組、斑蝥酸鈉組及聯合用藥組的細胞百分比均明顯高于空白對照組（P均＜0.001），聯合用藥組明顯高于兩個單藥組（P均＜0.05）。S期、G2期各用藥組則均較空白對照組低。提示兩藥單用及聯合用藥均可使細胞阻滯于G1期。見表3。

2.3 索拉非尼組、斑蝥酸鈉組及聯合用藥組對肝癌HepG2細胞ERK、pERK蛋白表達的影響

Western blot法檢測結果顯示，兩個單藥組及聯合用藥組ERK蛋白的表達與空白對照組比較差異無統計學意義（F=2.928，P=0.100）。而索拉非尼組及聯合用藥組pERK蛋白的表達較空白對照組低（P＜0.05），而斑蝥酸鈉組則高于空白對照組（P=0.023）。見圖1。

表1 不同濃度及不同時段索拉非尼組、斑蝥酸鈉組和聯合用藥組對肝癌HepG2細胞的抑制率［（±s）%］

表1 不同濃度及不同時段索拉非尼組、斑蝥酸鈉組和聯合用藥組對肝癌HepG2細胞的抑制率［（±s）%］

S1、S2、S3、S4分別為索拉非尼2μmol/L、4μmol/L、6μmol/L、8μmol/L；月1、月2、月3、月4分別為斑蝥酸鈉1.94μmol/L、3.88μmol/L、5.82μmol/L、7.76μmol/L。

組別24 h 48 h 72 h單藥組S1 9.25±5.89 23.90±3.74 36.14±2.26 S2 13.07±5.31 37.51±4.73 56.37±2.33 S3 30.64±3.70 59.18±3.58 66.97±1.33 S4 41.30±2.84 62.19±3.98 65.52±2.31月1 9.51±2.70 16.07±4.24 14.84±5.69月2 13.15±2.80 25.65±3.30 36.03±7.16月3 21.63±6.30 46.80±3.44 59.24±2.03月4聯合用藥組30.67±3.67 63.05±2.40 71.88±1.51 S1+月1 10.17±3.07 36.59±5.29 36.90±2.53 S2+月2 25.44±4.44 63.12±5.44 68.63±1.56 S3+月3 39.41±4.79 71.41±5.16 77.12±0.81 S4+月4 48.10±3.23 75.19±5.26 77.19±0.76

表2 聯合用藥組對肝癌HepG2細胞協同抑制作用的q值

表3 索拉非尼組、斑蝥酸鈉組及聯合用藥組對肝癌HepG2細胞細胞周期的影響［（±s）%］

表3 索拉非尼組、斑蝥酸鈉組及聯合用藥組對肝癌HepG2細胞細胞周期的影響［（±s）%］

索拉非尼組為4μmol/L，斑蝥酸鈉組為3.88μmol/L，聯合用藥組為索拉非尼4μmol/L+斑蝥酸鈉3.88μmol/L。

組別G0/G1期S期G2期空白對照組49.89±3.30 34.57±3.02 16.98±2.28索拉非尼組64.86±1.44 21.51±0.57 13.62±2.00斑蝥酸鈉組60.68±1.48 27.57±0.44 11.76±1.21聯合用藥組69.13±1.85 23.79±0.22 7.23±1.46

圖1 索拉非尼組、斑蝥酸鈉組及聯合用藥組對肝癌HepG2細胞ERK、pERK蛋白表達的影響

3 討論

肝癌是我國常見、高發的惡性腫瘤之一，因其發病隱匿，大多患者就診時已屬晚期，而全身化療效果較差，故尋找一種新的治療方案在臨床上具有重要意義。索拉非尼作為一種有效的肝癌化療藥物，現已大量應用于臨床，其對晚期肝癌患者已顯示出較好的臨床效果［3，4，6］。然而，在使用全劑量索拉非尼治療時也帶來一系列毒副反應，如腹瀉、手足綜合征等［7］。此外由于索拉非尼價格昂貴，因而促使研究者們探索用較小劑量聯合其他常規化療藥物或治療手段，以取得相同或更好治療效果的同時減少其使用量以減輕毒副反應。如索拉非尼聯合5-氟尿嘧啶、絲裂霉素、順鉑［7，8］等常規化療藥物，以及塞來昔布［9］、雷公藤［10］等其他藥物，以上研究結果均發現聯合用藥均能增強索拉非尼的抗癌效能，甚至成倍提升抗癌作用。然而，上述與索拉非尼聯合的藥物較少單用于肝癌的治療，或僅作為局部用藥。目前用于治療肝癌較為理想的聯合方案仍在探索中。本研究中與索拉非尼聯合作用的斑蝥酸鈉是斑蟊素的衍生物，其保留了斑蟊素的抗癌能力，而毒副反應則較斑蝥素小。斑蟊素是一種蛋白磷酸酶2A（PP2A）抑制劑，可誘導多種腫瘤細胞凋亡，包括肺、胃、肝等惡性腫瘤［11］。而PP2A可通過抑制Raf/MEK/ERK信號傳導通路最終下調pERK1/2的水平［12］，同時去甲斑蟊素可通過抑制PP2A上調pERK1/2的水平［13］。因而，我們推測斑蝥酸鈉或許可使pERK1/2的表達上調，影響其抑制作用，而索拉非尼可靶向性抑制pERK1/2的表達。因此，根據此契合點，本文試圖探討、觀察索拉非尼聯合斑蝥酸鈉對肝癌HepG2細胞的抑制作用。

通過實驗發現，索拉非尼、斑蝥酸鈉及二者聯合用藥時均對肝癌HepG2細胞產生明顯的抑制增殖作用，且呈劑量-時間依賴效應，在索拉非尼濃度為4μmol/L、斑蝥酸鈉濃度為3.88μmol/L的24 h和72 h兩個時間段，兩藥表現為相加作用，在48 h表現為協同作用；當濃度分別為6μmol/L和5.82μmol/L時，則皆為相加作用。由此認為，索拉非尼聯合斑蝥酸鈉是值得探索的聯合方案之一。

有研究發現索拉非尼通過抑制周期特異性蛋白cyclin-D1、cyclin-D3及周期蛋白依賴性激酶4（cdk4）和cdk6，使細胞無法通過G1-S期，因此被阻滯在G1期［14］。而對于斑蝥酸鈉，有研究發現其類似物去甲斑蝥素可通過下調cdk6和微小染色體維持蛋白2（Mcm2），阻止肝癌HepG2細胞進入S期，阻滯在G1期［15］。本研究結果亦發現索拉非尼及斑蝥酸鈉單藥均可使肝癌HepG2細胞被阻滯在G1期，而聯合用藥時，通過上述兩種機制的影響，雙重阻滯，使更多的細胞阻滯在G1期，進一步印證了上述觀點。

Raf/MEK/ERK促分裂原活化蛋白（MAP）激酶信號傳導通路的激活是肝癌發生過程中的一個重要變化。當此通路被激活后，細胞的生存及增殖能力得以增強，同時還能通過促進血管內皮生長因子（VEGF）和血小板源性生長因子（PDGF）的表達刺激血管生成，進而促進腫瘤的生長［7］。因此，Raf/MEK/ERK信號傳導通路成為肝癌的治療靶點之一。Western blot法檢測顯示，索拉非尼及斑蝥酸鈉單藥及聯合用藥的ERK蛋白表達與空白對照組相比無明顯差異，但索拉非尼組及聯合用藥組pERK蛋白的表達則明顯較空白對照組低，而斑蝥酸鈉組高于空白對照組。這一實驗結果進一步證實了本研究前期推論，即斑蝥酸鈉可促進pERK蛋白的表達，而與索拉非尼聯合用藥時，可減少斑蝥酸鈉所引發的pERK蛋白的表達上調，最終使pERK蛋白的表達下降。因此，抑制Raf/ MEK/ERK信號傳導通路可能是兩藥聯合抑制肝癌HepG2細胞增殖的機制之一。

隨著分子靶向治療研究的不斷深入，探索有效的治療肝癌聯合方案成為熱點之一，索拉非尼在單藥治療肝癌取得肯定療效后，本研究通過索拉非尼聯合中藥斑蝥酸鈉的體外實驗，證明了其具有協同或相加抑制肝癌HepG2細胞增殖的作用，可為肝癌的臨床治療提供一定參考。然而，其機制及聯合用藥方案和臨床療效還需進一步臨床試驗加以探索。

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［2014-12-29收稿］［2015-03-02修回］［編輯羅惠予］

Anti-proliferative effects of combining Sorafenib and sodium cantharidinate in HepG2 liver cancer cells

CHEN Zhigang1，2，LU Haofeng1，2，ZHU Jiye1，2，HUANG Shan1，WU Guobin1，LI Lequn1，ZHAO Yinnong1（1Department of Hepatobiliary Surgery，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University；2Graduate School of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

ZHAO Yinnong.E-mail：Yinongzhao@263.com

ObjectiveTo investigate the anti-proliferative effects of combining Sorafenib and sodium cantharidinate on HepG2 liver cancer cells.M ethodsHepG2 cells were treated with sorafenib alone，sodium cantharidinate alone or both together；control cells were left untreated.The CCK-8 assay was used to measure antiproliferative effects of different drug concentrations；flow cytometry，to measure cell cycle distribution；and Western blotting，to measure expression of ERK and pERK.Results月oth sorafenib and sodium cantharidinate on their own or together inhibited HepG2 proliferation in a dose-dependentway，with the combination proving significantly more potent than either drug on its own（P＜0.05）.Combining the two drugs led to an additive antiproliferative effect，except at a concentration of 4μmol/L of sorafenib and 3.88μmol/L of sodium cantharidinate at 48 h，when a synergistic effectwas observed.The proportion of cells arrested in G1phase was significantly greater with either drug alone or both together than in the absence of drug（P＜0.001），and itwas significantly higher for the two drugs together than for either drug alone（P＜0.05）.ERK was not significantlyaffected by either drug on its own or by the combination（P=0.1），while pERK levels were significantly lower with sorafenib alone or both drugs together than in the absence of drug（P＜0.05）.Conversely，the pERK levelwas significantly higherwith sodium cantharidinate alone than in the absence of drug（P=0.023）.ConclusionThe combination of sorafenib and sodium cantharidinate can exerta synergistic antiproliferative effect on HepG2 cells，and this effectmay be due to cell cycle arrest and inhibition of the RAF/MEK/ERK signaling pathway.

Liver neoplasm；Sorafenib，Sodium cantharidinate；Anti-proliferative effects；Signaling pathway

R735.7

A

1674-5671（2015）02-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.02.04

國家自然科學基金資助項目（81360315）；廣西衛生廳科研基金資助項目（重2012087）；廣西衛生廳自籌經費科研課題（Z2011228）

趙蔭農。E-mail：Yinongzhao@263.com