腦發育期缺碘對大鼠學習記憶功能的影響

[摘要] 目的 探討腦發育期缺碘對大鼠學習記憶功能的影響。 方法 大鼠飲用含質量濃度為0.3 g/L甲硫咪唑的自來水誘發腦發育不同時期缺碘大鼠模型，E1組為胚胎期缺碘模型鼠，P1組為出生后1～50 d缺碘模型鼠，P30組為出生后30～50 d缺碘模型鼠，N組為正常對照鼠。觀察其子代大鼠的行為學改變，利用放免法測定大鼠血清游離三碘甲腺原氨酸（FT3）和四碘甲腺原氨酸（FT4）水平，采用HE染色及TUNEL法觀察大鼠的腦組織形態學改變。 結果 P30組的血清游離FT3和FT4水平顯著低于N組，差異有統計學意義（P<0.05）?！癥”迷宮實驗結果顯示，P1和P30組的正確反應率顯著低于N組，差異有統計學意義（P<0.05）。P1組的達標所需天數顯著多于N組，差異有統計學意義（P<0.05）。P1組的記憶保持率顯著低于N組，差異有統計學意義（P<0.05）。P1組的正確反應率、記憶保持率顯著低于E1組，達標所需天數顯著多于E1組，差異有統計學意義（P<0.05）。P1組的正確反應率顯著低于P30組，達標所需天數顯著多于P30組，差異有統計學意義（P<0.05）。P1組和P30組的皮質細胞凋亡數顯著多于N組，差異有統計學意義（P<0.05）。P1組的皮質、海馬細胞凋亡數顯著多于E1組和P30組，差異有統計學意義（P<0.05）。P1組的小腦細胞凋亡數顯著多于E1組，差異有統計學意義（P<0.05）。 結論 腦發育時期缺碘能夠導致大鼠學習記憶功能發育障礙，其發生與腦組織細胞凋亡增多有關。

[關鍵詞] 腦發育；缺碘；大鼠；學習記憶功能

[中圖分類號] R-332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2015）07（b）-0008-04

[Abstract] Objective To explore the influence of iodine deficiency in brain development on rat′s learning and memory functions. Methods Iodine deficiency models of rats in different periods of brain development were induced by drinking tap water containing 0.3 g/L thiamazole.Iodine deficiency of model rat in embryonic period was classified into E1 group，iodine deficiency of model rats 1 to 50 d and 30 to 50 d after birth were named as P1 group and P30 group respectively，and normal control group was set as N group.Change of behavioristics in offspring rats was observed.Serum free triiodothryonine （FT3） and free thyroxine or tetraiodothyronine （FT4） was determined by radioimmunoassay respectively.Morphological change of rat′s brain tissue was observed by HE staining and TUNEL. Results The level of serum FT3 and FT4 in P30 group was lower than that in E1 group and P1 group，with significant difference（P<0.05）.In the “Y” maze experiments，the rate of correct response in P1 group and P30 group N group was lower than that in N group，with significant difference（P<0.05）.The days of reachting the standards in P1 group was more than that in N group，with significant difference（P<0.05）.The rate of memory retention in P1 group was lower than that in N group，with significant difference（P<0.05）.The rate of correct response and memory retention in P1 group was lower than that in E1 group，with significant difference（P<0.05）.The days of reachting the standards in P1 group was more than that in E1 group，with significant difference（P<0.05）.The rate of correct response in P1 group was lower than that in P30 group，with significant difference（P<0.05）.The days of reachting the standards in P1 group was more than that in P30 group，with significant difference（P<0.05）.The apoptosis number of cerebral cortex cell in P1 group and P30 group was more than that in N group，with significant difference（P<0.05）.The apoptosis number of cerebral cortex and hippocampus cell was more than that in E1 group and P30 group，with significant difference（P<0.05）.The apoptosis number of cerebellum cell was more than that in E1 group，with significant difference（P<0.05）. Conclusion Iodine deficiency in brain development can lead to disorders of learning and memory functions in rats，which is probably related with apoptosis of brain tissue.

[Key words] Brain development；Iodine deficiency；Rat；Learning and memory functions

碘是合成甲狀腺激素的必需原料，而甲狀腺激素對神經系統發育有重要作用，尤其是對大腦發育，是非常重要的一種激素。如果在腦發育時期碘缺乏或不足，將發生嚴重的腦功能障礙；如果孕婦孕期缺碘或嬰兒出生后母乳、飲食缺碘可出現感覺遲鈍、步態異常和智力減弱等癥狀，而早發現、早診斷、早治療是防治的關鍵[1-3]。調查研究顯示，腦發育期碘缺乏可引起學習記憶功能障礙及智力低下[4-5]。目前，大多數研究認為這一現象的發生與腦組織細胞凋亡增多密切相關[6]。本研究通過觀察腦發育不同時期缺碘大鼠模型學習記憶功能及腦組織形態學的不同變化，探討缺碘對大鼠學習記憶功能形成及發育的影響，旨在為甲狀腺功能減退患兒的臨床防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

①實驗動物：SD大鼠20只（雌雄比為3∶1），由省醫學實驗動物中心買進。在實驗室常規飼養1周，待其適應環境后，雌雄大鼠按3：1合籠。②主要試劑：甲硫咪唑從美國Sigma公司官網郵購，TUNEL試劑盒由國內南京凱基生物科技發展有限公司提供，放免試劑盒從天津九鼎醫學生物工程有限公司郵購。

1.2 方法

1.2.1 缺碘大鼠模型制備[7]及分組[8] 本實驗共分4組，具體分組如下。第1組（胚胎期缺碘模型組）：懷孕母鼠從懷孕的第1天開始至仔鼠出生，飲用含質量濃度為0.3 g/L的甲硫咪唑自來水，母鼠在仔鼠出生后的1～21 d（母乳喂養期）飲用正常自來水；仔鼠在出生后21 d斷奶，直至出生后50 d的這段時間內飲用正常自來水；雌雄仔鼠分開飼養，簡寫為E1組。第2組（出生后1～50 d缺碘模型組）：母鼠在仔鼠出生后的1～21 d（母乳喂養期）飲用含質量濃度為0.3 g/L的甲硫咪唑自來水，仔鼠在出生后21 d斷奶，直至出生后50 d的這段時間內飲用含質量濃度為0.3 g/L的甲硫咪唑自來水；雌雄仔鼠分開飼養，簡寫為P1組；第3組（出生后30～50 d缺碘模型組）：母鼠在仔鼠出生后的1～21 d（母乳喂養期）飲用正常自來水，仔鼠在出生后21 d斷奶，在出生后30～50 d飲用含質量濃度為0.3 g/L的甲硫咪唑自來水；雌雄仔鼠分開飼養，簡寫為P30組；第4組（正常對照組）：母鼠和仔鼠均飲用正常自來水，直至仔鼠出生后50 d。

1.2.2 血清游離FT3和FT4的測定 N組出生后第1天和第50天取血，E1組出生后第1天取血，P1和P30組出生后第50天取血。心臟取血經離心后保存，樣品全部收集后統一拿到華僑醫院核醫學科，在專業人員協助下完成測定。

1.2.3 “Y”迷宮實驗 本研究選用固定次數隨機不休息法[9]，“Y”迷宮實驗中的正確、錯誤判定標準如下：實驗大鼠受到電擊后，迅速從起步區直接逃到安全區記錄為“正確反應”；若是逃到其他無燈光的任何一臂，則記錄為“錯誤反應”；若是實驗大鼠轉身向所在的起步區反方向逃竄也記錄為“錯誤反應”。各組大鼠在出生后的第45～50天由專人負責實驗，每天于相同時間、相同地點，固定訓練20次，測試結果分為以下兩種：①20次測試中連續正確反應次數≥9次；②20次測試中總的正確反應次數≥18次。如果①和②滿足一個，則記為達標。本研究選用正確反應率、達標所需天數、24 h記憶保持率3個指標反映被測大鼠的學習記憶功能。

1.2.4 腦組織形態學檢測 各實驗組大鼠在出生后的第50天灌注取腦，本研究選用的麻醉方法為腹腔注射350 mg/kg的水合氯醛，首先剪開心包，暴露大鼠的心臟，然后在心尖部位插管到升主動脈，再用止血鉗把針頭固定，接著再剪開右心耳，快速注入溫度為37℃的生理鹽水200 ml，再緩慢注入溫度為4℃、體積分數為4%的多聚甲醛溶液200 ml。灌注、固定實驗步驟完成后，手術取出完整腦組織，將大鼠的大、小腦分別裝于盛有體積分數為4%多聚甲醛溶液的容器中浸泡、固定24 h以上，然后做石蠟包埋，常規石蠟切片，每片厚約4 μm，部分切片做HE染色，觀察大鼠腦組織的細胞形態學變化。另外，部分切片采用TUNEL法檢測細胞凋亡，具體操作方法參考原位細胞凋亡檢測試劑盒說明書。各組大鼠隨機選取不同腦區的5個視野拍照并計數。

1.3 統計學處理

采用SPSS 13.0統計學軟件對數據進行分析，計量資料以x±s表示，采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，均數間兩兩比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血清游離FT3和FT4水平的比較

P30組的血清游離FT3和FT4水平顯著低于N組，差異有統計學意義（P<0.05）。E1和P1組的血清游離FT3和FT4水平低于檢測限或無檢測結果（表1）。

2.2 各組“Y”迷宮實驗結果的比較

P1和P30組的正確反應率顯著低于N組，差異有統計學意義（P<0.05）。P1組的達標所需天數顯著多于N組，差異有統計學意義（P<0.05）。P1組的記憶保持率顯著低于N組，差異有統計學意義（P<0.05）。P1組的正確反應率、記憶保持率顯著低于E1組，達標所需天數顯著多于E1組，差異有統計學意義（P<0.05）。P1組的正確反應率顯著低于P30組，達標所需天數顯著多于P30組，差異有統計學意義（P<0.05）。（表2）。

2.3 各組HE染色結果的比較

光鏡下N組大鼠的腦組織HE染色結果顯示，腦組織分層清晰，細胞數量較多，細胞界限清晰，多有突起，胞質豐富，胞核大而且圓，核仁清晰可見。與N組比較，P1組大鼠的腦組織HE染色結果顯示，凋亡細胞皺縮，細胞體積縮小，可見細胞外空隙、胞核固縮、深染（圖1）。

P1組和P30組的皮質細胞凋亡數顯著多于N組，差異有統計學意義（P<0.05）。P1組的皮質、海馬細胞凋亡數顯著多于E1組和P30組，差異有統計學意義（P<0.05）。P1組的小腦細胞凋亡數顯著多于E1組，差異有統計學意義（P<0.05）（表3，圖2）。

3 討論

地方性克汀病又稱地方性呆小病，是胚胎期和新生兒期嚴重缺碘的結果。本病病因比較明確，主要是由于缺碘影響甲狀腺激素合成而導致。某些以神經型表現為主的地方性克汀病就是由于胚胎早期嚴重的宮內碘缺乏損害神經細胞生長發育所致，其臨床表現為身高低于正常，其中甲狀腺腫大者占15.3%，多數為輕度腫大，智力呈中至重度減退；表情淡漠、聾啞、精神缺陷、痙攣性癱瘓、眼斜視；膝關節屈曲、膝反射亢進，可出現病理反射，如巴賓斯基征陽性；無明顯的甲狀腺功能減退表現。亞臨床型甲狀腺功能減退患者尤其是兒童患者，其認知功能損害比較明顯，表現為分類、領悟、編碼、知識、言語等各項指標均低于對照組[10]。相關研究顯示，在腦發育期，缺碘導致的甲狀腺功能減退患者記憶能力明顯降低[11-12]。先天性甲狀腺功能減退大鼠在水迷宮實驗中的逃避潛伏期、游泳路程延長，游泳速度減慢[13]。出生后50 d的甲狀腺功能減退仔鼠在避暗實驗中達標所犯次數明顯增多，24 h記憶潛伏期明顯縮短[5-6，14]。本研究結果顯示，P1組和P30組缺碘大鼠在“Y”迷宮實驗中的正確反應率顯著降低，P1組缺碘大鼠在“Y”迷宮實驗中的達標所需天數顯著延長，記憶保持率顯著降低，提示甲狀腺激素在腦功能發育中尤其是在學習記憶功能的發育和形成過程中有重要作用。

海馬一直被認為是認知功能形成和發育的重要解剖結構基礎，其參與學習記憶功能的形成。海馬中的CA1區域和大腦空間學習記憶功能相關，記憶在這個區域編碼、存儲。研究顯示，有幾種重要基因參與學習記憶功能的形成，即早基因在長時記憶形成中發揮重要作用，這一作用和神經元的可塑性有關。甲狀腺功能減退時，海馬組織中的即早基因表達降低[15-16]，印證了這一觀點。缺碘導致的甲狀腺激素合成減少可導致海馬功能受損，尤其是對學習記憶功能的損害表現更為明顯，如水迷宮實驗結果更差，而且受損的嚴重程度和體內甲狀腺激素降低或不足的程度、持續時間及發生年齡有密切關系[17]。相關研究顯示，即使從母鼠懷孕第6天開始直至仔鼠出生后第30天，母鼠口服較低劑量甲狀腺激素合成抑制藥物（丙基硫氧嘧啶）引起的甲狀腺激素缺乏也可導致仔鼠海馬CA1區和鋸齒狀腦回的突觸傳遞混亂，即突觸的可塑性混亂，嚴重者可引起海馬學習記憶功能損害[18]。腦發育期甲狀腺激素合成不足或減少可明顯導致海馬CA1區以及齒狀回區LTP的表現和特性出現異常改變[17，19]。相關研究顯示，甲狀腺功能減退大鼠海馬CA3區的LTP明顯降低[20]。本研究結果顯示，P1組缺碘大鼠的腦組織海馬HE染色鏡下可見凋亡細胞皺縮、細胞體積明顯縮小以及細胞外空隙、細胞核固縮、深染；TUNEL染色可見陽性細胞（凋亡細胞）數明顯增多，提示海馬發育障礙是腦發育期缺碘導致大鼠學習記憶功能障礙的重要生理病理基礎之一。

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（收稿日期：2015-02-06 本文編輯：祁海文）