四個不結球白菜自交不親和S單元型分子鑒定

李霞等

摘要：利用已報道的SRK及SLG基因序列保守區設計的特異性引物，通過PCR 擴增和克隆測序，結合生物信息學分析方法對4份國外引進的不結球白菜（Brassica campestris ssp. chinensis Makino）自交不親和材料的S單元型進行分子鑒定。結果表明，不親和材料A1包含的S位點基因序列與甘藍（B. oleracea L. var. capitata L.）SLG-31的相似度為98%（E值是0）；不親和材料A2、A3包含ClassI類及ClassⅡ類2種S單元型，S位點處于雜合狀態。不親和材料A4包含的S位點基因序列與青花菜（B. oleracea L. var. italica Plenck）單倍型BOI1 SRK蛋白基因具有98 %的序列相似度，序列覆蓋度達99%。

關鍵詞：不結球白菜（Brassica campestris ssp. chinensis Makino）；自交不親和；S單元型；分子鑒定

中圖分類號：S634.3；Q321+.7；Q503 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）16-3948-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.16.030

Molecular Identification of S Haplotypes in Four Self-Incompatible Germplasm Resources of Brassica campestris ssp. chinensis

LI Xia，HU Zhen-hua，ZHOU Guo-lin，WANG Ai-hua

（Wuhan Vegetable Demonstration Center of Wuhan Vegetable Research Institute， Wuhan 436400， China）

Abstract： Using the primers designed according to the conserved sequence of S locus kinase （SRK） gene and S locus glycoprotein （SLG） gene， by PCR amplification， combined with bio-informatics analysis the S haplotypes of 4 Brassica campestris ssp. chinensis Makino self-incompatibility material from overseas were identified. The results indicated that the A1 self-incompatible line showed 98% similarity with SLG-31 gene in B. oleracea L. var. capitata L.； and the A2， A3 self-incompatible line both contained two types of S haplotype from Class I and ClassⅡ， which showed that the S locus were at heterozygous state. The A4 self-incompatible line showed 98% similarity with BOI1 SRK gene in B. oleracea L. var. italica Plenck under 99% query coverage.

Key words： Brassica campestris ssp. chinensis Makino； self-incompatibility； S haplotype； molecular identification

白菜（Brassica campestris L.）屬十字花科（Cruciferae）蕓薹屬（Brassica L.），原產于中國，栽培歷史悠久。其規模無論是面積還是產量，在蔬菜作物中均居首位。不結球白菜，又稱小白菜（B. campestris L. ssp. chinensis Makino），主要分布在長江流域的中、下游地區，其播種面積約占該地區蔬菜總面積的1/3。白菜為典型的異花授粉作物，雜種優勢顯著，利用自交不親和（Self-incompatibility）系制種是目前最常用的白菜雜交制種技術之一，其主要靠不同單倍型自交不親和系之間互配來獲得，因此對于育種工作者來說，獲得自交不親和系單倍型的快速準確鑒定至關重要。目前普遍采用花期交互授粉的方法進行鑒定，其操作過程繁雜、效率低、準確度不高[1]?？焖?、準確的鑒定白菜自交不親和性以及所攜帶的S單元型（在遺傳上由具有復等位基因的多態性S位點基因控制的單元類型），不僅可以加速自交親和系和自交不親和系的選育進程，而且可以做到有針對性地配制雜交組合、提高育種效率、避免雜交不結實現象發生。

自交不親和現象是植物在長期進化過程中促進異花授粉、保證物種生存、延續的生殖特性。根據遺傳控制不同，顯花植物的自交不親和特性大致可分成配子體自交不親和（Gametophytic self-incompatibility，GSI）與孢子體自交不親和（Sporophytic self-incompatibility，SSI）2種類型[2]。配子體自交不親和是植物界最普遍的一種自交不親和類型，而孢子體自交不親和僅存在于十字花科、石竹科（Caryophyllaceae）、菊科（Compositae）等植物中。蕓薹屬是十字花科孢子體控制型的典型代表，研究表明，蕓薹屬植物自交不親和性受單位點（S-locus）復等位基因（S1，S2，……，Sn）的控制，在白菜自交不親和研究中已鑒定出100多種S單元型[3， 4]。目前，自交不親和機理研究認為，自交不親和現象的發生是花粉與柱頭乳突細胞間的自我識別引起的，其識別過程主要體現為S單倍型特異性的受體-配體識別機制，參與這一識別過程的蛋白主要包括：S位點糖蛋白基因（S locus glycoprotein gene，SLG基因）、S位點受體激酶基因（S locus receptor kinase gene，SRK基因）、花粉蛋白外殼基因（S locus cysteine-rich protein gene，SCR基因）。其中SLG和SRK為柱頭表達蛋白基因，SCR為花粉壁中存在的特異因子基因，3個緊密連鎖的基因參與了花粉和柱頭間的相互識別[5-7]。隨著分子生物學技術的不斷發展及蕓薹屬植物自交不親和性的深入研究，若干S單元型SLG、SRK和SCR基因序列也已確定。隨著DNA測序技術的飛速發展，通過生物信息學分析，白菜自交不親和S單元型分子水平的快速鑒定也已成為可能。

試驗利用已公布的SRK、SLG基因特異引物的PCR擴增、克隆測序及生物信息學分析等技術，對4份引進的小白菜自交不親和材料A1、A2、A3、A4的S單元型進行分子鑒定，以期為小白菜雜交組合的授粉配制提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

參試的不結球白菜自交不親和材料A1，A2，A3及A4都從國外引進，由武漢市蔬菜科學研究所提供。離心柱型PCR產物回收試劑盒購于北京天根生化科技有限公司，pMD18-T載體購于寶生物工程 （大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 選取各材料的幼嫩葉片，利用改良的CTAB小樣法提取4份試驗材料的基因組DNA，置于-20 ℃環境保存備用。

1.2.2 引物設計 利用已報道的特異性引物PS5和PS15，該引物是由Nishio等[8]設計的用于擴增ClassⅠ類（S單元型在花粉中表現為顯性）SLG的引物，特異引物P3和P4是張愛芬[9]設計用于擴增ClassⅡ類（S單元型在花粉中表現為隱性）SRK基因的引物，引物序列見表1，引物合成由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

1.2.3 PCR擴增 分別以4份材料的基因組DNA為模板，PCR 反應體系為20 μL。擴增程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸90 s， 35個循環； 72 ℃延伸10 min，25 ℃保存。在1.0%瓊脂糖凝膠中進行電泳產物檢測，紫外凝膠成像系統拍照。

1.2.4 目的片段的回收及克隆 利用PCR產物回收試劑盒對目的片段進行回收，將回收DNA片段連接到pMD18-T載體上，轉化到感受態大腸桿菌（Escherichia coli）上，進行藍白斑篩選，對陽性克隆進行PCR鑒定。

1.2.5 測序及序列分析 對于鑒定的陽性克隆送樣測序，每個樣品測定2～3 個陽性克隆，測序由上海生工生物工程技術服務有限公司實施。序列分析利用DNAstar 軟件完成；Blast分析通過NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）在線進行。

2 結果與分析

2.1 S單元型相關基因的PCR擴增

利用蕓薹屬ClassⅠ類S單元型SLG基因特異性引物組合PS5+PS15及ClassⅡ類SRK基因特異性引物組合P3+P4對4份自交不親和材料A1、A2、A3、A4進行PCR擴增，結果見圖1。從圖1可見，A1材料只在PS5+PS15引物組合中有擴增產物，A4只在P3+P4引物組合中有擴增產物，而A2、A3在2對引物擴增條件下都有特異性條帶出現。以上結果表明，A1可能屬S單元型中的ClassⅠ類，A4則屬于ClassⅡ類S單元型。A2和A3的擴增結果表明在這2份不親和材料中很有可能包括了2類S單元型，在S位點表現為雜合類型。為了進一步對以上結果進行驗證，對上述4份自交不親和材料中擴增出的目標片段進行回收，并分別連接到pMD18-T載體上，進行大腸桿菌轉化，挑取陽性克隆進行序列測定。

2.2 自交不親和材料擴增序列的Blast分析

將4份自交不親和材料擴增產物的DNA序列測定結果與NCBI已登錄的蕓薹屬核苷酸序列進行Blast比對，以進一步確定它們的S單元型。Blast分析表明，自交不親和材料A1由PS5+PS15引物所擴增出的1 356 bp的片段經克隆測序結果比對后發現，其與甘藍（B. oleracea L. var. capitata L.）SLG-31（GenBank 登錄號 AB054729.1）在序列覆蓋率為94%的情況下，相似度為98%（E值是0）。而與白菜S位點蛋白1基因（GenBank 登錄號 HM629338.1）在序列覆蓋度為80%的情況下，與其CDS序列相似度達到了99%（E值是0）。以上結果顯示，自交不親和材料A1的S位點基因序列在較高的序列覆蓋度情況下，與甘藍SLG-31具有較高的相似度；而與白菜蛋白基因1所屬的S單元型在較低的序列覆蓋度下序列相似度更高。因此，要準確鑒定其S單元型，需要進一步的試驗來驗證。

自交不親和材料A2在2對引物擴增條件下都有擴增條帶產生，包括1 356 bp及1 046 bp 2條特異性擴增條帶。對1 394 bp的序列進行比對后發現，該序列與白菜的S位點糖蛋白SLG-30基因（GenBank登錄號 D85217.1）及蕪菁（B. rapa L.ssp.rapifera Matzg）的S位點受體激酶基因SRK-30 （GenBank登錄號AB054693.1）的序列具有很高的相似度，分別為99%和98%。因此基本可以確定不親和材料包含S30這一單元型。對1 059 bp片段的序列比對后發現，其與蕪菁SRK-60、SLG-60基因（GenBank 登錄號 AB097116.1）在覆蓋度為99%的情況下，相似度也高達99%，遠遠高于其他單元型，因此可以確定該序列屬于S60單元型。所以自交不親和材料A2基本上可以確定其具備S30、S60這2種S單元型，再一次證明自交不親和材料A2在S位點為雜合狀態。

自交不親和材料A3也如A2材料，在ClassⅠ類及ClassⅡ類S單元型引物中都擴增出了對應的目的條帶，分別為1 356 bp及1 046 bp。對2條序列的分析結果表明，前者與蘿卜（Raphanus sativus L.）SGT-63基因（GenBank登錄號 EF056499.1）在序列覆蓋率為98%的條件下，序列相似度為99%；后者則與青花菜（B. oleracea L. var. italica Plenck）單倍型BOI1 SRK蛋白基因（GenBank登錄號 JQ253785.1）具有98%的序列相似度，序列覆蓋度達99%。以上結果表明，不親和材料A3在S位點也證實為雜合狀態。

自交不親和材料A4屬于ClassⅡ類S單元型，對其1 046 bp片段的序列分析結果（圖2）表明，自交不親和材料A4所包含的ClassⅡ類S位點基因序列與自交不親和材料A3中的S位點基因序列一致，2個材料應包含同一類型的S基因。

3 討論

白菜為典型的異花授粉作物，雜種優勢顯著。利用自交不親和系制種，主要靠不同單倍型自交不親和系之間的互配來獲得，因此對于育種工作者來說，獲得自交不親和系單倍型的快速鑒定至關重要。目前已有很多鑒定自交不親和性的方法，主要包括：親和指數法[10]、熒光顯微法[11]、等電點聚焦電泳法[12]、免疫測定法[13]、RFLP-PCR（Restriction Fragment Length Polymorphism-Polymerase Chain Reaction，限制性片段長度多態性-聚合酶鏈式反應）分子鑒定法[9]。以上方法難以對所研究材料進行準確的S單元型鑒定。隨著DNA測序技術的迅速發展，以及公開報道的S單元型序列的增多，使得通過PCR擴增后直接測序來判定自交不親和材料的S單元型成為可能。分子鑒定法能夠實現早期對植株自交不親和性S單元型的鑒定，從而大大提高了檢測效率，避免了雜交不結實現象的發生，具有非常廣闊的應用前景。本研究利用SLG及SRK基因的保守序列設計的引物，對4份不結球白菜進行了S單元型的分子鑒定，結果表明，該方法基本可以鑒定出4份材料的S單元型類型，其中發現ClassⅠ類和ClassⅡ類S單元型同時出現在自交不親和材料A2和A3中，這種現象在前人的研究中也有相關的報道。張愛芬[9]對16份不結球白菜材料S單元型的鑒定中，發現有11份材料同時擴增出ClassⅠ類和ClassⅡ類2種類型，自交不親和S位點處于雜合狀態；這種現象也曾在白菜的一些自交不親和系中出現過，其原因可能是由于其自交不親和性導致其自我結實困難、而外來花粉在繁殖過程中又極易侵入、造成在表型上很難加以區分基因位點的雜合與否所產生的[14]；因此，出現了很多親本材料在S位點上并不是完全純合的現象。所以在進行新的不親和種質資源引進及繁殖不親和材料時，應該嚴防外來花粉的侵入，做好隔離措施，以保證其純度，同時輔以分子技術手段快速實現其S單元型的鑒定，從而提高不親和材料系的選育及組合選配效率。

此外，在對4份白菜自交不親和材料的S單元型鑒定的過程中還發現，在做S位點基因序列分析時，其中大部分序列與甘藍、蘿卜等其他十字花科作物中所包含的的S位點基因序列表現出了極高的相似度。例如，在自交不親和材料A3中其1 356 bp片段的序列分析結果表明，A3與蘿卜S位點糖蛋白SGT-63基因（GenBank登錄號 EF056499.1）在序列覆蓋度為98%的條件下，序列相似度為99%；而自交不親和材料A4所包含的S基因序列與青花菜單倍型BOI1 SRK蛋白基因（GenBank登錄號 JQ253785.1）具有98%的序列相似性，序列覆蓋度達99%。在十字花科不親和研究中，通過比較基因組研究發現，青花菜和蕪菁的S位點基因具有高度的相似性，白菜中S單倍型S46、S47、S8分別和甘藍的3種S單倍型S7、S12、S32在SRK基因方面均有高度的相似性，種間雜交發現它們之間也表現出相同的自交不親和識別特異性[15]。同樣蘿卜屬（Raphanus L.）作物蘿卜也具有和蕓薹屬作物高度同源的SLG、SRK和SP11基因，經過核酸序列的聚類分析并不能將兩者分開。這些數據表明，十字花科S位點基因的多態性在蕓薹屬和蘿卜屬分化成不同的種屬以前已經形成，并很可能來自于共同的祖先[16]。本研究中，4份自交不親和材料所包含的幾種S單元型，從基因組序列分析的結果來看，與甘藍及蘿卜中的一些S位點基因序列相似度很高，是不是具有相同的識別特異性，還有待進一步通過試驗來證實。

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