血清化血小板裂解液替代胎牛血清對牙周膜細胞膜片形成的影響

殷 園, 祝金浩, 吳瑞鑫, 陳發明, 張曦予

(1. 軍事口腔醫學重點實驗室, 陜西省口腔醫學重點實驗室, 第四軍醫大學口腔醫院牙周科, 陜西 西安 710032; 2. 解放軍77626部隊醫院, 西藏 拉薩 851400)

·基礎研究·

血清化血小板裂解液替代胎牛血清對牙周膜細胞膜片形成的影響

殷 園1, 祝金浩2, 吳瑞鑫1, 陳發明1, 張曦予1

(1. 軍事口腔醫學重點實驗室, 陜西省口腔醫學重點實驗室, 第四軍醫大學口腔醫院牙周科, 陜西 西安 710032; 2. 解放軍77626部隊醫院, 西藏 拉薩 851400)

目的: 觀察血清化血小板裂解液(PLS)替代胎牛血清(FBS)對牙周膜細胞(PDLCs)體外擴增和膜片形成的影響。方法：首先從人全血白膜中分離出血小板富集物，利用凍融法與鈣離子激活法聯合制備PLS；然后分別用含100 g/L的 PLS(實驗組)和100 g/L FBS(對照組)培養液對PDLCs進行體外培養和成膜誘導，分別采用MTT、RT-PCR和HE染色法檢測兩組細胞的增殖、成膜以及膜片中成膜相關基因/蛋白的表達水平。結果：MTT檢測結果顯示，與對照組相比，實驗組可支持PDLCs的體外擴增，二者的生長曲線無差異(P>0.05)；成膜誘導培養10 d后, RT-PCR檢測顯示， 實驗組的膜片中除Collagen I的表達水平顯著低于對照組(P>0.05)外，另兩種成膜相關基因(Integrin β1、Fibronectin)的表達水平與對照組相比均無顯著差異(P>0.05)；組織學觀察顯示，兩組細胞膜片的形態和厚度亦無顯著性差異(P>0.05)。結論：PLS可以替代FBS用于牙周膜細胞的體外培養和膜片誘導。

牙周膜細胞(PDLCs); 血小板裂解液; 胎牛血清; 細胞膜片; 轉化醫學

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.12.001

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(12): 703]

胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)因富含各種生長因子和維持細胞生長的某些生物活性物質，一直以來都是細胞體外培養中不可缺少的營養補充物質[1]。但由于其異種屬來源的屬性，具有攜帶動物疫源性疾病的病原體(如朊蛋白)和引起人體免疫排斥的風險；目前，雖然某些臨床實驗也在使用FBS培養出的細胞進行疾病治療和組織再生，但其潛在的安全問題仍然令人擔憂，因而也阻礙了相關實驗室成果的進一步臨床轉化[2-3]。人血小板裂解液(platelet lysate, PL)作為一種人血來源的物質，富含多種生長因子和生物活性物質，已在多種細胞的體外培養中成功替代FBS。但是PL的一個重要缺陷在于含有纖粘蛋白和其他凝血因子，用來作為培養基補充物時需添加肝素以防止凝膠形成[4]。而商品化的肝素通常是從豬體內提取，雖然已被批準可用于人體，但是仍有對肝素過敏的報道[5-6]。有文獻報道，在PL中加入鈣離子使其先通過形成凝膠以去除凝血物質后，再取其上清液，即可得到血清化血小板裂解液(serum-converted platelet lysate，PLS)；由于PLS中仍保留有大多數的生長因子，其不僅可以支持骨髓間充質干細胞的體外擴增，同時還可避免當PL作為培養基補充物時對肝素的使用[7]。但是，有關PLS對牙周膜細胞(PDLCs)的作用目前尚未見相關研究報道。

細胞膜片作為近年來組織工程技術的研究熱點，其不僅可以通過保護細胞外基質、細胞間連接等結構，以維持細胞分化、分泌等生理功能，同時還可提高種子細胞的移植效率、減少細胞的流失率[8]。目前，已有動物實驗乃至臨床試驗嘗試將牙周膜細胞膜片用于臨床治療，并取得了較為理想的結果[9-11]。但是相關研究在細胞培養營養時所用的營養補充物都是FBS，從而使其在下一步的臨床轉化中必然要充分考慮安全性問題，因而探索牙周膜細胞膜片培養中合適的營養補充物是十分必要的。本實驗旨在探索LPS替代FBS用于PDLCs體外培養的可能性，并觀察其對PDLCs形成的影響，以期為臨床轉化提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

α- MEM培養基、磷酸鹽緩沖液(PBS)(Hyclone，美國)；FBS(杭州四季青)；青、鏈霉素(北京索萊寶)；Ⅰ型膠原酶 、牛血清白蛋白(BSA)(Sigma- Aldrich，美國)；胰蛋白酶(Amresco，美國)；RNAiso、PrimeSeriptTM反轉錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(Takara，日本)；Western及IP細胞裂解液、Bradford蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天)；PVDF膜(Millipore，美國)；Anti-Collagen I antibody (EPR7785)、 Anti- Fibronectin antibody (F14)、Anti- Integrin beta 1 antibody (EPR16895)(Abcam，美國)；HRP標記的山羊抗兔二抗、β- tublin一抗(北京康為世紀)；6孔培養板、平底96孔板(NEST，香港耐思生物科技)；二氧化碳恒溫孵箱(Heraeus，德國)；YJ- 875 型超凈工作臺(蘇州凈化設備廠)；離心機(Kub- ota 2100，日本)；倒置相差顯微鏡及照相系統(Olympus，日本)；超聲震蕩儀(上海生源)；酶聯免疫檢測儀(BIO- TEK，美國)；CFX ConnectTMReal- Time PCR檢測系統、蛋白電泳儀(Bio- Rad，美國)；Tanon 5200 全自動化學發光圖像分析系統(上海天能)。

1.2 PDLCs的分離、培養

收集我院頜面外科因阻生而拔除的第三磨牙(無齲、無牙周炎)，患者知情同意。拔除后立刻放入預冷的α- MEM培養液中運回實驗室，并用含青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL的PBS溶液沖洗至液體清亮、牙體表面無明顯血污為止。用無菌11號刀片刮取根中1/3的牙周膜組織并剪碎后，離心(800 r/min，5 min)棄上清；然后收集沉淀部分，并加入3 mg/mL的Ⅰ型膠原酶消化60 min(37 ℃、50 mL/L CO2)。消化完成后離心棄去膠原酶，加入10 mL PBS重懸、洗滌并離心，棄上清；收集細胞并用2 mL α- MEM(含100 mL/L 胎牛血清)重懸后，接種于35 mm的塑料培養皿中，轉移至孵箱中靜置培養(37 ℃、50 mL/L CO2)。每3 d換液，并用倒置顯微鏡觀察細胞的生長情況，待細胞生長匯合至80%時，用2.5 g/L胰酶消化并傳代。取P4代細胞用于后述實驗。

1.3 PLS的制備

首先從西京醫院血庫收集檢疫合格的科研用人全血白膜(全血離心去除大部分紅細胞和血漿后的部分)，1 000 r/min離心15 min后棄去底層的紅細胞和中層的白細胞，吸取上層富含血小板的血漿部分并經計數后-80 ℃保存備用。為了避免個體差異，共收集了20份人全血白膜并將其混合在一起，所有獻血者的年齡均在35歲以下，所分離出的血小板富集物濃度均在1×109/mL以上。然后參考文獻[7]報道的方法制備PLS：取上述收集的血小板富集物分別經-80/37 ℃反復凍融3次后，按照100 ∶1的比例添加0.2 g/mL的CaCl2溶液，并置于4 ℃下靜置過夜使之形成凝膠；次日取出凝膠，以4 000 g、4 ℃的條件離心30 min，收集上清并經0.22 μm無菌濾器過濾后分裝，-80 ℃保存備用。

1.4 PLS與FBS支持PDLCs增殖的比較觀察

取第4代PDLCs以500/孔的密度接種到96孔板，每孔加入200 μL含100 g/L FBS的α- MEM常規條件下培養24 h后，棄去原培養液并將細胞隨機分為兩組；其中實驗組加入含100 g/L PLS的α-MEM，對照組加入含100 g/L FBS的α-MEM繼續培養，每2 d換液1次。分別于培養后第1、2、3、4、5、6、7天各時間點取各組細胞(每組每個時間點各5孔)進行檢測。具體方法如下：待測孔每孔各加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，避光孵育4 h(37 ℃、50 mL/L CO2)后小心吸凈培養液，再于每孔各加入150 μL DMSO并震蕩10 min；然后用酶標儀檢測各孔590 nm波長處的吸光度值(OD)。所得OD值減去空白對照孔(即不接種細胞，僅有培養液，其余操作一致)的本底OD值即為該孔的實際測量值。

1.5 PLS與FBS對PDLCs膜片形成影響的比較

1.5.1 實驗分組和成膜誘導培養

取P4代PDLCs以5×105/孔的密度接種于6孔板，常規條件下培養至細胞生長達80%匯合時，棄原培養液，并將細胞隨機分為兩組；其中實驗組加入含100 g/L PLS的成膜誘導液(即含有50 μg/mL 維生素C的α-MEM)，對照組加入含100 g/L FBS的成膜誘導液進行成膜誘導培養。每2 d換液1次，連續誘導培養10 d后進行以下相關指標檢測。

1.5.2 成膜相關基因的檢測

取成膜誘導10 d的各組細胞膜片，用PBS洗滌3遍后，使用RNAiso提取細胞總RNA，并采用PrimeSeriptTM反轉錄試劑盒合成cDNA(1 000 ng、20 μL體系)。然后以cDNA為模板，以GAPDH作為內參照，用CFX ConnectTMRT-PCR檢測系統和SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒以及相應的引物分別檢測兩組細胞中I型膠原(Collagen I)、整合素β1(Integrin β1)和纖連蛋白(Fibronectin)的mRNA表達水平。PCR反應體系、反應條件均按照相應試劑盒說明嚴格執行。所用引物由上海生物工程公司合成，具體序列見表1。

表1 real-time PCR引物序列

1.5.3 成膜相關蛋白的檢測

取成膜誘導10 d的各組細胞膜片，用PBS洗滌3遍后，使用添加有蛋白酶抑制劑的Western及IP細胞裂解液提取細胞總蛋白(冰上超聲裂解后12 000 r/min、4 ℃離心15 min取上清)，并用Bradford蛋白濃度測定試劑盒檢測總蛋白濃度。然后分別從每組中各取30 μg總蛋白，用80 g/L SDS聚丙烯酰胺凝膠進行電泳后，再以濕轉法(200 mA、3 h)將蛋白轉移至PVDF膜上，并將其置于50 g/L的BSA溶液中室溫下搖床封閉2 h；根據分子量分別滴加TBST稀釋的Anti-Collagen I antibody(EPR7785)、Anti-Fibronectin antibody(F14)、Anti-Integrin beta 1 antibody(EPR16895)一抗，并4 ℃ 孵育過夜；次日TBST洗膜5 min×3次，滴加HRP標記的山羊抗兔二抗室溫下搖床孵育2 h；再次用TBST洗膜5 min×3次，并用增強型化學發光顯影試劑盒進行顯影后，采用Image J進行條帶灰度分析，取目的條帶與內參β-tublin條帶灰度值的比值作為該樣本中蛋白的相對含量。

1.5.4 細胞膜片的形態學觀察

取成膜誘導10 d的各組細胞膜片，分別經PBS洗滌3次、40 g/L多聚甲醛固定2 h后，常規石蠟包埋、切片。所得切片經二甲苯脫蠟、梯度乙醇逐級脫水、HE染色后，鏡下觀察并拍照；然后使用Image J軟件對各組膜片的厚度進行定量分析。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 兩種培養條件下 PDLCs的生長曲線比較

MTT結果顯示：使用100 g/L PLS進行細胞培養時(實驗組)，PDLCs仍可以正常增殖，其生長曲線與在含100 g/L FBS的培養液中培養的PDLCs(對照組)基本一致；各時間點內兩組細胞的生長情況(OD值)相比，除在培養后第2、3天時實驗組的OD值明顯低于對照組(P<0.05)外，其他各時間點內兩組細胞的OD值均無統計學差異(P>0.05)(圖1)。

圖1 PDLCs在兩種培養條件下的生長曲線比較(* P<0.05)

2.2 兩種培養條件對PDLCs中成膜相關基因、蛋白表達的影響

兩種培養條件下對PDLCs進行成膜誘導10 d后，分別采用RT- PCR、Western blot對兩組膜片中Collagen I、Integrin β1、Fibronectin的基因和蛋白進行檢測顯示, 實驗組膜片中的Collagen I mRNA和蛋白的表達水平均明顯低于對照組(P<0.05)；而兩組在Integrin β1和Fibronectin的表達水平方面，無論是基因水平還是蛋白水平，差異均無統計學意義(P>0.05)(圖2～3)。

圖2 兩種培養條件下PDLCs中各成膜相關基因的mRNA表達水平比較

圖3 兩種培養條件下PDLCs中各成膜相關蛋白的表達水平比較

2.3 兩種培養條件下PDLCs膜片的形態學比較

在成膜誘導液中添加100 g/L PLS或100 g/L FBS時，均可成功誘導PDLCs形成膜片，肉眼觀察顯示，兩組膜片均呈乳白色、半透明狀，且可以從邊緣完整揭起(圖4)；組織切片后，H&E染色觀察顯示，使用100 g/L PLS培養的細胞膜片的平均厚度雖略低于100 g/L FBS培養的膜片，但二者無統計學差異(圖5～6)。

圖4 兩組細胞膜片的大體觀察

圖5 兩組細胞膜片的組織學觀察(HE染色，×400)

圖6 兩組細胞膜片的厚度比較±s)

3 討論

近年來隨著組織工程技術的飛速發展，越來越多的實驗成果將有待于臨床轉化，組織工程細胞體外擴增是進行實驗成果向臨床應用轉化不可缺少的步驟。目前在組織工程細胞體外擴增的過程中，多數研究均常規使用FBS作為營養補充物。但作為異種來源物質，FBS本身具有不可避免的生物安全隱患：可能攜帶動物疫源性疾病的病原體，如朊蛋白和支原體，這是目前使用過濾除菌方法無法清除的；此外在細胞培養的過程中，部分細胞會內吞FBS中的蛋白成分，這樣很可能在應用于人體時造成異源性免疫排斥反應[12]。因此，研究者嘗試了各種方案以替代FBS用于細胞的大規模體外擴增的營養補充物。其中血小板裂解液(PL)富含多種生長因子，且制備簡單、價格低廉，似乎是目前替代FBS最為理想的選擇。有報道提出，使用PL代替FBS進行細胞體外擴增是安全有效的，并且在培養過程中不會改變培養細胞的多向分化潛能或表面標記[12-13]。但是，傳統的血小板裂解液需要添加從豬的小腸黏膜中提取加工而來的藥用肝素，以防止其中的凝血物質凝聚。藥用肝素在臨床上偶有過敏的報道，過敏原因可能是由于種屬差異或者制備過程中可能的污染或成分不純所致[6,14]；另有報道指出，肝素的使用可能會影響某些細胞功能，如干擾骨髓來源的單個核細胞在心血管修復中的遷移和歸巢[15]。作為不向血小板裂解液中添加肝素的血清化血小板裂解液(PLS)，可以完全杜絕異種物質—肝素的使用，因此，其越來越受到研究者的關注。

牙周病作為一種慢性疾病，可導致牙松動甚至脫落，影響著人類的口腔健康。PDLCs是牙周膜韌帶中的細胞，其形成的細胞膜片在牙周再生的臨床應用中受到廣泛關注。牙周膜細胞膜片通過將牙周韌帶正常細胞體外擴增培養，從而形成多層細胞膜片，可應用于撕脫牙再植、牙周組織缺損等疾病，幫助形成正常的牙周韌帶纖維、牙骨質和牙槽骨等牙周組織，對其再生發揮了巨大的作用[16-17]。目前，針對PLS的研究主要集中于誘導干細胞成骨方向，還沒有對PLS作為PDLCs體外培養營養補充物進行的具體研究。本實驗使用PLS替代FBS，成功實現了PDLCs的體外培養和膜片誘導。在PDLCs的體外擴增中，100 g/L 的PLS可以達到與100 g/L FBS相近的促進細胞增殖效果。在接下來的研究中我們將考慮設置PLS的濃度梯度，以尋找是否存在優于100 g/L的FBS方案。雖然在成膜誘導過程中，使用100 g/L PLS作為營養補充物時，其細胞外基質中的Collagen I基因和蛋白的表達水平較使用100 g/L FBS時有所下降，且膜片的厚度也有下降的趨勢(無統計學差異)，但依然成功誘導并形成了膜片，而且另外兩種重要的成膜相關基因Integrin β1和Fibronectin的表達水平均與100 g/L FBS相比無顯著性差異。以上結果提示，PLS可以替代FBS用于膜片誘導。當然如何選擇合適的濃度以及是否需要適當調整成膜誘導液的成分等尚需要進一步的探索。

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Replacement of fetal bovine serum with serum-converted platelet lysate in the preparation of periodontal ligament cell sheet

YIN Yuan*, ZHU Jin- hao, WU Rui- xin, CHEN Fa- ming, ZHANG Xi- yu

(*StateKeyLaboratoryofMilitaryStomotology,DepartmentofPeriodontology,SchoolofStomatology，TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710032,China)

AIM: To evaluate the possibility of replacing fetal bovine serum (FBS) with serum-converted platelet lysate (PLS) in the ex-vivo expansion of periodontal ligament cells (PDLCs) and the cell sheet formation. METHODS: PLS was prepared from buffy-coat platelet concentrate using a combination of freezing-thawing method and calcium-activating method. 100 g/L PLS(PLS group) and 100 g/L FBS(FBS group) were respectively used during the culture and sheet-induction of PDLCs. The growth curve, sheet formation, and the expression level of genes and proteins associated with sheet-formation were examined by MTT assay, RT-PCR and HE staining respectively. RESULTS: Cell proliferation in the 2 groups showed no difference (P>0.05). After 10 days of cell sheet formation culture, RT-PCR showed that the expression of collagen I was reduced in PLS group (P>0.05) . The expression of integrin β1 and fibronectin, genes related to cell sheet formation showed no difference between the 2 groups (P>0.05). No significant difference was noticed in the shape and thickness of cell sheets between the 2 groups (P>0.05). CONCLUSION: PLS can substitute FBS in supporting the expansion and sheet formation of PDLCs.

periodontal ligament cells(PDLCs); platelet lysate; fetal bovine serum; cell sheet; translational medicine

2015-09-02

國家自然科學基金(81500853)

殷 園(1992-)，女，漢族，江蘇鹽城人。碩士生(導師：陳發明)

張曦予，E-mail：39298025@qq.com

R780.2

A

1005-2593(2015)12-0703-06