熱滅活牙齦卟啉單胞菌對人間充質干細胞增殖和成骨分化的影響

劉靜波, 李 琛, 郭 艷, 張冬梅, 趙海礁, 潘亞萍

(中國醫科大學口腔醫學院 遼寧省口腔醫學研究所: * 牙周科, ** 中心實驗室, 遼寧 沈陽 110002)

熱滅活牙齦卟啉單胞菌對人間充質干細胞增殖和成骨分化的影響

劉靜波*, 李 琛*, 郭 艷**, 張冬梅*, 趙海礁*, 潘亞萍*

(中國醫科大學口腔醫學院 遼寧省口腔醫學研究所:*牙周科,**中心實驗室, 遼寧 沈陽 110002)

目前: 探討熱滅活牙齦卟啉單胞菌(Pg)對人間充質干細胞(HMSCs)增殖和成骨分化的影響。方法：①將常規培養24 h后的HMSCs隨機分為2組, 實驗組加入熱滅活Pg，對照組加入等量無菌PBS, 共同培養24 h后，用細胞計數試劑盒-8檢測兩組細胞的增殖活性; ②將常規培養24 h后的HMSCs隨機分為3組，實驗組加入熱滅活Pg，對照組和基線組加入等量無菌PBS繼續培養；待細胞匯合度達90%時，取基線組細胞直接用于ALP活性及成骨相關基因的PCR檢測；而實驗組和對照組則再進行成骨誘導培養14 d后，采用RT-PCR法檢測其RUNX- 2、ALP mRNA的表達水平。結果：熱滅活Pg與HMSCs共同培養24 h后，其細胞的增殖雖明顯低于對照組(P<0.05)，但其細胞形態則與對照組基本一致；成骨誘導14 d后, 實驗組細胞中的ALP活性和成骨相關基因RUNX- 2、ALP mRNA的表達水平均低于對照組(P<0.05)，高于基線組(P<0.05)。 結論：HMSCs在熱滅活Pg刺激下增殖和成骨能力明顯降低。

牙齦卟啉單胞菌(Pg); 成骨分化; 細胞增殖; 成骨分化

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.12.002

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(12): 709]

牙周炎是發生于牙周支持組織的慢性炎癥性疾病，是我國成年人失牙的主要原因之一，且與多種系統性疾病的發生發展關系密切[1]。當牙周組織因炎癥被破壞后，其結構和功能的重建一直是牙周病學研究領域中的重點和難點。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,Pg)是與牙周炎密切相關的紅色復合體中的重要成員，被認為是毒力最強的牙周致病菌之一。本課題組前期研究表明，牙周基礎治療后6周時，在牙周炎患者的炎癥得到控制的齦溝內有Pg開始重新定植[2]。由于這一時期正是牙周組織再生的關鍵期，因此也說明Pg對牙周組織再生的影響不容忽視。本實驗擬采用熱滅活Pg刺激人間充質干細胞(HMSCs)，并觀察其對HMSCs增殖和成骨分化的影響，以期為研究牙周炎患者牙周組織再生提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 熱滅活Pg菌懸液的制備

首先將PgATCC 33277菌株(中國醫科大學附屬口腔醫院口腔生物學教研室保存)接種于BHI固體培養基(添加氯化血紅素、維生素K和無菌脫纖維羊血)，置于37 ℃厭氧條件(800 mL/L N2、100 mL/L H2、100 mL/L CO2)下培養7 d后，再轉種于BHI液體培養基繼續厭氧培養過夜；然后離心(9 000 r/min)10 min并收集細菌，以新鮮配置的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次并重懸后，用紫外分光光度計進行活菌計數。計數后的Pg菌懸液經70 ℃孵育1 h，并用0.22 mm無菌濾器過濾[3]后，從中取10 mL接種于BHI固體培養基進行厭氧培養(條件同上)；連續培養5 d，并確定無菌落形成后，即可將其用于后續實驗。

1.2 HMSCs的培養和傳代

取脂肪來源的HMSCs(Lifeline，美國)接種于專用間充質干細胞生長培養液 (StemLife LL-0034)(Lifeline，美國)中，并置于37 °C、50 mL/L CO2的條件下進行培養。隔日換液1次，待細胞匯合度達90%時，進行傳代。取第3代細胞進行實驗。

1.3 滅活Pg對HMSCs增殖影響的觀察

取第3代對數生長期HMSCs，用25 g/L的胰蛋白酶(Gibco，美國)消化后，以1 000 /孔的細胞密度接種于96孔板，并于每孔中各加入100 μL專用間充質干細胞生長培養液，置于37 ℃、50 mL/L CO2條件下進行培養。培養24 h后，將細胞隨機分為2組: 實驗組按照細菌 ∶細胞=100 ∶1的比例加入熱滅活的Pg菌懸液[4]; 對照組加入等體積的無菌PBS。兩組繼續培養24 h后，用倒置相差顯微鏡(上海研潤光機)觀察各組細胞的生長情況；然后分別取各組細胞按照細胞計數試劑盒-8(大連美侖生物)的操作說明，于每孔中各加入10 μL細胞計數試劑并繼續培養2 h后，用酶標儀(SmartSpec 300)(Biochrom，日本)分別測定各孔450 nm波長處的吸光度值(OD值)。

1.4 滅活Pg對HMSCs成骨分化影響的觀察

1.4.1 分組處理和成骨誘導培養

取第3代對數生長期HMSCs以10 000 /孔的細胞密度接種于24孔板， 每孔中各加入1 mL專用間充質干細胞生長培養液，置于37 ℃、50 mL/L CO2條件下培養24 h后，將細胞隨機分為實驗組、對照組和基線組， 實驗組按照細菌 ∶細胞=100 ∶1比例加入Pg熱滅活菌懸液；對照組和基線組加入等體積無菌PBS繼續培養。待細胞增殖達90%匯合時，收集基線組細胞直接用于ALP和成骨相關基因的檢測；實驗組和對照組細胞用無菌PBS洗滌2次后再加入新鮮配置的成骨誘導液[5](含50 μg/mL 維生素C、 10 mmol/L β-甘油磷酸酯的間充質干細胞生長培養液)進行成骨誘導培養，每3 d 換液1次，誘導培養至14 d后用于ALP和成骨相關基因檢測。

1.4.2 ALP檢測

分別取上述各組細胞用細胞裂解液裂解細胞后加入顯色底物和檢測緩沖液，并置于37 ℃條件下孵育30 min，然后用酶標儀分別測定其405 nm波長處的吸光度值(OD值)。以上所有操作均嚴格按照ALP檢測試劑盒(上海碧云天)說明書。

1.4.3 成骨相關基因表達的PCR檢測

分別取上述各組細胞用TRIzol 法提取細胞總RNA，并用高性能反轉錄試劑盒(Life technologies，美國)合成cDNA；然后以cDNA為模板，以GAPH作為內參照，用ABI7700real-time PCR儀和SYBR GREEN試劑盒(Qiagen，美國)分別對RUNX-2、ALP基因進行RT-PCR分析。所用引物由寶生物公司合成，具體引物序列參照文獻[6]。PCR反應體系共20 μL，分別為：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL、上下游引物各0.8 μL、cDNA模板2.0 μL、ROX Reference DyeⅡ0.4 μL、dH2O 6.0 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性30 s后，95 ℃、5 s，58 ℃、34 s，40個循環。PCR反應結束后，采用2-ΔΔCt方法計算各基因的mRNA相對濃度。試驗重復 3次。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 熱滅活Pg對HMSCs增殖的影響

HMSCs與熱滅活Pg共同培養24 h后，倒置相差顯微鏡觀察，其細胞形態與對照組基本一致，呈多角形，且貼壁生長；但其細胞匯合度則低于對照組(圖1)。細胞計數試劑盒-8檢測結果顯示，實驗組細胞的增殖情況(OD值)顯著低于對照組(P<0.05)(圖2)。

實驗組 對照組

*與對照組相比P < 0.05

2.2 熱滅活Pg對HMSCs成骨分化的影響

2.2.1 熱滅活Pg對ALP活性的影響

ALP活性檢測結果顯示：實驗組(熱滅活Pg刺激后的HMSCs)和對照組(未經熱滅活Pg刺激的HMSCs)細胞經成骨誘導14 d后，兩組細胞中的ALP活性均較基線組(未經成骨誘導的HMSCs)明顯升高(P<0 .05 )；其中以對照組的ALP活性升高最明顯，與實驗組相比差異亦有統計學意義(P<0.05)(圖3)。

*與基線組相比P<0.05；#與實驗組相比P<0.05

2.2.2 熱滅活Pg對RUNX-2和ALP基因表達的影響

RT-PCR檢測結果顯示：實驗組(熱滅活Pg刺激的HMSCs)和對照組(未經熱滅活Pg刺激的HMSCs)細胞經成骨誘導14 d后， 兩組細胞中的RUNX-2和ALP基因表達水平均較基線組(未經熱滅活Pg刺激和成骨誘導的HMSCs)明顯升高(P<0.05 )；其中對照組升高最明顯，兩種基因的表達水平均明顯高于實驗組(P<0.05 )(圖4)。

*與基線組相比P<0.05；#與實驗組相比P<0.05

3 討論

牙周炎是以牙周組織破壞為特征的感染性疾病，當牙周組織因炎癥被破壞后，重建牙周組織的正常生理結構和功能一直是牙周治療追求的最終目標。Pg是目前公認的牙周致病菌之一，可產生多種毒力因子和蛋白，在牙周炎的發生發展過程中發揮著重要的作用。牙周基礎治療是減少或清除Pg的定植，但在治療后短期內Pg又會在齦下區域重新定植[2, 7]。此時，牙周組織的再生不可避免的會受到齦下微環境中細菌(尤其是Pg)的影響。因此，本研究通過構建熱滅活Pg(熱滅活Pg能夠保留大部分的細菌功能蛋白)刺激HMSCs模型來模擬機體齦下炎癥微環境，以探討Pg蛋白對HMSCs增殖和成骨分化的影響，以期為牙周炎患者牙周組織再生的研究提供參考。

以往研究表明，HMSCs能夠重建包括牙周韌帶、牙骨質、牙槽骨在內的全部牙周組織，已成為牙周組織再生可以選擇的細胞源之一，從而為重建牙周組織的正常結構創造了便利條件[8-9]。目前國內外研究主要使用牙周膜細胞和骨髓間充質干細胞作為牙周再生的種子細胞。本研究選用的脂肪來源的HMSCs與上述兩種細胞相比，獲取更加方便，且對供體創傷較小，具有更廣闊的臨床應用前景。

Krebirel等通過構建Pg和HMSCs共培養模型進行研究發現，在培養72 h后仍有40%的細胞存活，其細胞因子IL-8的分泌水平較低[10]。本實驗中發現，熱滅活Pg與HMSCs共同培養24 h后，雖能明顯抑制HMSCs的增殖，但仍有大量細胞存活，其形態與對照組相比亦無明顯差異，僅細胞匯合度有所下降。該結果提示，部分HMSCs在Pg刺激條件下仍能夠存活并增殖，與Krebirel等的實驗結果相似。

ALP是成骨細胞及干細胞成骨分化時的一種細胞表面標志性酶，其表達水平會隨著細胞成骨分化程度的增加而增強；RUNX-2是參與調控間充質干細胞向成骨方向分化的特異性轉錄因子，兩者均為骨骼形成和發育的關鍵性標志基因。有研究發現，Pg脂多糖與牙周膜細胞共同培養后，能夠顯著抑制牙周膜細胞的ALP活性，及其膠原蛋白1和骨鈣素的產生[11]。本研究中發現，對熱滅活Pg刺激的HMSCs再進行成骨誘導14 d后，與未經成骨誘導的基線組相比，其細胞中的RUNX-2和ALP基因表達水平均明顯上調；但與對照組相比，兩基因的表達水平均明顯降低。同時還發現，成骨誘導14 d時的ALP活性檢測結果與RT-PCR 檢測結果的變化趨勢一致。以上結果提示，HMSCs在Pg蛋白的刺激下仍能進行成骨分化，但與未經Pg蛋白刺激HMSCs相比，其成骨能力顯著降低。

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[2]劉靜波，林莉，潘亞萍，等. 牙周炎患者基礎治療后牙齦卟啉單胞菌的定植研究[J]. 中華口腔醫學雜志，2008, 43(8):478-482.

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The effect of heat-inactivatedPorphyromonasgingivalison the proliferation and osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells

LIU Jing- bo*, LI Chen, GUO Yan, ZHANG Dong- mei, ZHAO Hai- jiao, PAN Ya- ping

(*DepartmentofPeriodontology,SchoolofStomatology，ChinaMedicalUniversity，LiaoningInstituteofDentalResearch，Shenyang110002，China)

AIM: To investigate the effect of heat-inactivatedPorphyromonasgingivalis(HIPg) on the proliferation and osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells (HMSCs). METHODS: Cultured HMSCs were co- incubated with HIPgand PBS respectively for 24 h, then the cell proliferation was examined by a cell counter kit- 8. HMSCs were cultured with HIPgsupernatant (base line group) and sterile PBS(control group) until the cells reached 90% confluence. The cells in baseline group were collected, and the cells in treatment group and control group were incubated in osteogenic medium for 14 days. Then cells were harvested, alkaline phosphatase (ALP) activity was examined by ALP- kit and the mRNA level of ALP and RUNX- 2 was tested by RT- PCR. RESULTS: Heat- inactivatedPgreduced the proliferation of HMSCs (P<0.05) and ALP activity (P<0.05), decreased the mRNA level of RUNX- 2 (P<0.05) and ALP (P<0.05). CONCLUSION: Heat- inactivatedPgmay inhibit the proliferation and osteogenic differentiation of HMSCs.

Porphyromonasgingivalis(pg); osteogenic differentiation; cell proliferation; osteogenic differentiation

2015-07-03；

2015-10-19

國家自然科學基金(81200785)

劉靜波(1980-)，女，漢族，遼寧沈陽人。博士，講師，主治醫師

潘亞萍，E-mail：yap_nancy@yahoo.comm

R780.2

A

1005-2593(2015)12-0709-04

遼寧省教育廳科學研究一般項目基金(L2013311)

遼寧省自然科學基金(2013021030)