肝細胞癌循環腫瘤細胞與腫瘤轉移和預后關系的研究

·生物治療·

肝細胞癌循環腫瘤細胞與腫瘤轉移和預后關系的研究

王真1,2，徐增輝1，鄭羅凝3，王穎1，孫保木4，金華君1，錢其軍1,2,3(1.東方肝膽外科醫院病毒基因治療實驗室，上海 200438；2.東方肝膽外科醫院生物治療科，上海 200438；3.浙江理工大學生命科學學院，杭州 310018；4.東方肝膽外科醫院中西醫結合科，上海 200438)

[摘要]目的研究肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)患者外周血循環腫瘤細胞(circulating tumor cell, CTC)與腫瘤轉移和預后的關系。方法選取35例肝細胞癌患者，應用密度梯度離心法聯合免疫磁珠陰性富集法富集CTC，然后利用染色體熒光原位雜交和細胞免疫熒光技術進行CTC鑒定并計數，同時記錄臨床相關特征，對數據進行統計學分析。結果所有患者均檢出CTC，陽性率為100%，CTC個數均值為(4.1±2.5)個。對患者進行分組，Ⅰ組的CTC個數<5，Ⅱ組的CTC數量≥5。Ⅰ組、Ⅱ組的CTC數量差異有統計學意義(P=0.001)，患者的性別、年齡與腫瘤轉移無關(P=0.581、0.531)，CTC的數量與轉移及預后有關(P=0.024、0.01)，Ⅰ組、Ⅱ組的轉移和預后差異有統計學意義。結論HCC患者外周血CTC的數量與腫瘤轉移及預后有關，CTC的數量≥5時，可能腫瘤更具轉移傾向，預后更差，患者生存期更短。

[關鍵詞]肝細胞癌；循環腫瘤細胞；轉移；預后

[基金項目]國家自然科學基金(No.81301307)；國家傳染病防治重大專項(No.2013ZX10002-010-007)；上海細胞治療工程技術研究中心科研基金(No.12DZ2251600)；上海市衛生局科研基金(No.20114179)

[作者簡介]王真，碩士研究生.研究方向：腫瘤免疫治療及循環腫瘤細胞的研究.Tel：15821381861;E-mail：wangzhenyangguang@163.com

[通訊作者]錢其軍，教授，博士生導師.研究方向：腫瘤基因-病毒治療和免疫治療、循環腫瘤細胞研究.E-mail：qianqj@sino-gene.cn

[中圖分類號]R73,R4[文獻標志碼]A

DOI[]10.3969/j.issn.1006-0111.2015.02.018

[收稿日期]2014-11-01[修回日期]2015-01-29

Study on the relationship of circulating tumor cells and metastasis and prognosis of hepatocellular carcinoma

WANG Zhen1,2, XU Zenghui1, ZHENG Luoning3, WANG Ying1,SUN Baomu4, JIN Huajun1, QIAN Qijun1,2,3(1.Laboratory of Gene and Viral Therapy,Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital, Shanghai 200438, China;2. Department of Biotherapy, Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital, Shanghai 200438, China; 3.College of Life Sciences, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China;4.Department of Integration of Traditional Chinese and Western medicine, Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital,Shanghai 200438, China)

Abstract[]ObjectiveTo study the relationship between circulating tumor cells(CTCs) in peripheral blood of the patients with hepatocellular carcinoma (HCC) and its metastasis and prognosis. Methods35 patients with hepatocellular carcinoma were collected as the research objects.CTCs density were enriched through gradient centrifugation and negative-immunomagnetic methods, then the cells were detected by chromosome fluorescence in situ hybridization combined with immunofluorescence tests to identify CTCs. The clinical characters were recorded and the data were statistically analyzed. ResultsAll the patients were detected CTC positive. The number of CTC was (4.1±2.5).The patients were divided into 2 groups.Group Ⅰ included patients whose CTCs were <5,and others were included in group Ⅱ.The difference between number of group I and group Ⅱ had significant significance(P=0.001);Metastasis had nothing to do with patients′ sex and age(P=0.581，0.531); The number of CTCs was related to metastasis and prognosis(P=0.024，0.01),and there was significant statistic significance between group I and group Ⅱ.ConclusionThe number of CTCs was related to tumor metastasis.The tumor may be more prone to occur metastasis and may had worse prognosis,and the patients may had shorter life time when the number of CTCs was≥5.

[Key words]hepatocellular carcinoma; circulating tumor cell; metastasis; prognosis

目前，對肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的檢查手段和治療方法不斷增多，但由于出現癌癥的復發和轉移，HCC的病死率仍較高[1]。HCC轉移、復發最重要的機制之一就是出現循環腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTC)。CTC隨血液循環到全身各處，在適宜的地方就會定居、增殖、生長，形成轉移瘤[2]。近年來，對CTC的研究越來越多，在前列腺癌[3]、結直腸癌[4]、乳腺癌[5]、肺癌[6]、卵巢癌[7]等一系列實體瘤患者的外周血中都發現了CTC的存在，CTC正逐漸成為腫瘤患者預后和實時監測治療反應的獨立預測因素。對于HCC患者，CTC具有同樣的意義。但是，目前關于HCC的CTC研究還比較少。HCC患者中CTC的數量與腫瘤侵襲、轉移及預后究竟存在怎樣的關系，尤其是在亞洲人群中HCC與CTC的關系如何，尚缺乏相關的臨床研究。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1HCC患者收集2013年6月至2014年1月東方肝膽外科醫院生物治療科收治的35位肝細胞癌患者。所有患者均經術后病理或細針穿刺活檢診斷為肝細胞癌；其淋巴結轉移情況經術后病理或影像學聯合臨床癥狀、甲胎蛋白確診。所有患者腫瘤分期不等，但近1個月內均未接受過相關抗腫瘤治療。所有患者均已取得知情同意并簽署知情同意書。

1.1.2主要試劑和器材細胞密度梯度分離介質60 ml、抗CD45免疫磁珠3 ml、2%多聚甲醛 4 ml、8號染色體探針(CEP-8) 200 μl、AlexaFluor 594標記的抗CD45抗體20 μl、Alexa Fluor 488標記的抗人細胞角蛋白18(CK18)抗體20 μl、DAPI熒光保存液120 μl(均賽特生物醫藥科技有限公司)。Triton X-100(上海博光生物科技有限公司)、TDL-40C型低速臺式大容量離心機(上海安亭科學儀器廠)、XMTA-6000型數顯鼓風干燥箱(上海葉拓儀器儀表有限公司)、GL-802B型微型臺式真空泵(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)、EDTA抗凝真空采血管(美國BD公司)、S500-24型ThermoBrite 原位雜交儀(美國 Westwood公司)、熒光顯微鏡(上海舜宇科技有限公司)。

1.2實驗方法CTC的富集和鑒定分別借鑒文獻[8-10]，富集利用密度梯度離心和免疫磁珠負篩法；CTC的鑒定利用FISH和IF法。具體操作稍有改動，簡略描述如下：采集患者外周血7.5 ml于EDTA抗凝采血管中，以800×g離心7 min，去除大部分血漿，然后利用密度梯度離心法，使用細胞分離介質以450×g離心8 min，去除紅細胞，再用150 μl的抗CD45免疫磁珠去除大部分白細胞，陰性富集CTC，最后用100 μl的2%多聚甲醛過夜固定CTC于載玻片上。第2天，先用10 μl的CEP-8探針進行DNA FISH雜交，然后用1 μl的抗CK18和1 μl的抗CD45免疫熒光抗體孵育，最后5 μl的DAPI染色，熒光顯微鏡下觀察、計數。

1.3CTC的判斷標準HCC的CTC為上皮來源的細胞，不表達CD45，且常有染色體異常，其CEP-8可為二倍體、三倍體，甚至多倍體；雖然CTC為上皮來源的細胞，但在其進入外周血的過程中可能已經發生了上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，故其可以表達CK18，也可以不表達CD18；DAPI則是細胞核的標志，故CTC的判斷標準為：CD45-/CD18+/二倍體/單個DAPI或CD45-/CD18-/二倍體/單個DAPI或CD45-/CD18+/三倍體/單個DAPI或CD45-/CD18-/三倍體/單個DAPI或CD45-/CD18+/多倍體/單個DAPI或CD45-/CD18-/多倍體/單個DAPI。例如，圖1為1個二倍體CTC，圖2為1個多倍體CTC。

2結果

2.1患者基本資料本實驗共納入原發性HCC患者35例，基本資料見表1。所有患者均已簽署知情同意書。35例患者多為中老年，年齡(51.8±10.7)歲，且多為中晚期腫瘤患者?；颊叩男詣e和年齡與腫瘤有無遠處和(或)淋巴結轉移無關(P=0.581、0.531，α=0.05)。同時，由于腫瘤的 TNM分期需要考慮腫瘤的轉移情況，故腫瘤的分期與腫瘤的轉移有關(P=0.039，α=0.05)。

圖1　1個二倍體CTC(×30) A.細胞的CD45陰性表達圖；B.CEP-8情況圖，為三倍體； C.DAPI染色圖

圖2　1個多倍體CTC(×30) A.細胞的CD45陰性表達圖；B.CEP-8情況圖，為多倍體；C.DAPI染色圖

表1　患者基本資料

2.2患者CTC檢測結果35例患者的CTC數量檢測結果為(4.1±2.5)個，筆者據此將所有患者分為兩組(圖3)：Ⅰ組為CTC數量<5個的患者，共23例，CTC個數介于0～4個不等，為(2.7±1.3)個，平均約3個；Ⅱ組為CTC數量≥5個的患者，共12例，CTC個數介于5～10個不等，為(6.8±1.8)個，平均約7個。兩組間的CTC數量差異有統計學意義(P=0.001，α=0.05)。

Ⅰ組的年齡介于27～64歲之間，為(50.8±11.09)歲，平均51歲，Ⅱ組的年齡介于39～72歲之間，為(53.8±10.19)歲，平均54歲，兩組的年齡無明顯差異(P=0.446，α=0.05)。

圖3　基于CTC數量的患者分組情況 ( ***P<0.001，與Ⅰ組比較)

2.3循環腫瘤細胞的數量與腫瘤有無淋巴結和(或)遠處轉移的關系患者入組時已有淋巴結和(或)遠處轉移的患者共17例(48.6%)，Ⅰ組8例，Ⅱ組9例，CTC數量介于0～10個不等，為(4.8±2.8)個；無淋巴結和遠處轉移的患者有18例(51.4%)，Ⅰ組15例，Ⅱ組3例，CTC數量介于1～10個，為(3.6±2.0)個。兩組患者的CTC數量差異有統計學意義(P=0.024，α=0.05)，可以認為HCC患者外周血CTC的數量與腫瘤有無遠處和(或)淋巴結轉移有關，HCC患者外周血CTC的數量≥5個時，可能腫瘤更容易發生淋巴節和(或)遠處轉移(圖4)。

圖4　兩組患者腫瘤有無轉移情況比較 ( *P<0.05，與Ⅰ組比較)

2.4循環腫瘤細胞的數量與患者預后的關系中晚期肝癌患者的預后較差，平均生存期可能僅3～6個月，筆者在試驗開始6個月后統計35例入組患者的生存情況，死亡20例，Ⅰ組10例(43.5%)，Ⅱ組10例(83.3%)，CTC的數量介于1～10個，為(5.1±2.5)個，平均約5個；存活15例，Ⅰ組13例(56.5%)，Ⅱ組2例(16.7%)，CTC的數量介于0～7個，為(2.9±1.8)個，平均約3個。兩組患者CTC的數量差異有統計學意義(P=0.01，α=0.05)，可以認為CTC的數量與腫瘤預后有一定關系，當HCC患者外周血CTC的數量≥5個時，可能腫瘤預后更差，患者生存期更短，病死率更高(圖5)。

圖5　兩組患者預后比較 ( **P<0.01，與Ⅰ組比較)

3討論

目前，雖然HCC的診斷和治療方法不斷提高，但預后仍較差，病死率居高不下，其主要原因就是晚期腫瘤的復發和轉移。HCC復發和轉移的機制尚不明確，CTC的出現被認為是其中一個重要因素。早在1869年就有人提出了CTC的概念[11]，即腫瘤從原發部位脫落進入外周血并隨之循環的腫瘤細胞，廣義上的CTC還包括進入淋巴系統循環的腫瘤細胞[2]。對于上皮來源腫瘤的CTC，毋庸置疑的具有上皮性表型。但是，近年來越來越多的研究報道發現，CTC會發生EMT，即上皮細胞為更好的存活并利于發生轉移和侵襲，通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程，CTC經過EMT，丟失部分上皮性表型，獲得了部分間質性表型[12,13]。

以往對于CTC的檢測多通過單一的腫瘤表面特異性分子鑒定，比如上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)、細胞角蛋白(cytokeratin,CK)，由于腫瘤本身特異性分子標志物較難確定以及上述EMT過程的存在，導致單一鑒定腫瘤表面分子標記的方法容易造成許多CTC被漏檢。

國內外對于HCC的CTC研究還比較少見，較為成熟的CTC研究方法如CellSearchTM也僅適用于乳腺癌等，并不適用于肝癌。曹宇勃等[14]檢索了常用的包括Pubmed在內的9大數據庫，檢索其自建庫至2013年8月1日期間所有關于HCC的CTC研究，并對其進行薈萃(Meta)分析，最后僅納入12項研究，這個數量相對于關于乳腺癌、結直腸癌等的CTC研究而言是極少的，其中關于中國人的研究僅4項，且所用的都是qRT-PCR方法；另外，此薈萃分析雖然得出了CTC與患者預后相關的結論，但未指出與HCC預后相關的具體CTC數量閾值。本研究為更多地富集到HCC患者的CTC細胞，采用陰性免疫磁珠和密度梯度離心聯合的方法來富集CTC，從而避免了陽性富集CTC方法中由于腫瘤表面標記物表達較高的異質性，而導致的CTC抓捕效果欠佳。同時，本研究采用了染色體熒光原位雜交和腫瘤表面分子標記免疫熒光的雙重方法來精確鑒定CTC細胞。

值得注意的是，檢測到的CTC均不表達CK18，考慮其原因可能為CTC發生EMT。Sun等[15]應用CellSearchTM檢測肝癌患者CTC的數量發現，有66.7%的患者術前CTC陽性，51%的患者術前的CTC數量≥2個，而且，這部分患者術后復發時間比CTC數量<2個的患者要早。本研究得出的肝癌患者CTC陽性率為100%，且影響腫瘤轉移和預后的CTC數量分界值為5，均高于Sun等的研究結果。兩項研究的主要區別在于Sun等采用的是CellSearch方法，基于上皮腫瘤細胞表面標記物EpCAM進行免疫磁珠捕獲，然后再用表面標記物CK進行鑒定。如前所述，可能由于腫瘤表面標記物表達的高異質性以及EMT轉化等過程的原因，以及后期單一的免疫熒光鑒定方法的缺陷，導致針對HCC患者的CTC分析結果與本研究有一定的差異；另外，本研究納入患者多為中晚期，而Sun等研究的納入患者則多為早期患者。因而，本研究得出的HCC患者的CTC陽性率以及與轉移、預后相關的CTC數量會與Sun等的研究有一定差異。

CTC的檢測具有重要的臨床意義。它有助于腫瘤的早期診斷、輔助診斷和預后評估，有助于快速評估手術、化療、放療、免疫治療等治療方案的療效和監測腫瘤的復發，還有助于尋找新的基因突變、治療靶點，研發新的治療藥物。尤其對于腫瘤的免疫治療，由于影像學變化出現得晚，難以及早判斷治療是否有效，而CTC這一指標則能通過數量的變化反映治療效果。檢測CTC的數量有望成為免疫治療療效的評估標準之一。目前關于CTC的臨床應用價值的研究(如前列腺癌、結直腸癌、乳腺癌、肺癌等)越來越多，CTC正在成為腫瘤患者預后及對治療反應的獨立預測因素。本實驗為研究肝癌患者CTC提供了一種可借鑒的方法，也初步揭示了肝癌患者CTC與腫瘤的轉移及預后的一些相互關系。今后仍需要更多的基礎研究和臨床數據的積累，以闡明CTC在肝癌轉移中的機制，以期建立基于CTC的肝癌早期診斷和預后指標。

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在我國，欠缺民事行為能力并不必然導致婚姻無效;俄羅斯則把其作為婚姻無效的法定事由，如患有精神疾病的人結婚導致婚姻無效并非由于其有該種疾病，而是因為該種疾病可以宣告其為無行為能力人。以下是一則無行為能力人結婚被宣告婚姻無效的實際案例:

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[本文編輯]李睿旻