一測多評法測定丹參中多種指標成分的含量

張　晨　邱　實　張彥飛　貢濟宇

(長春中醫藥大學，吉林　長春　130117)

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一測多評法測定丹參中多種指標成分的含量

張晨邱實張彥飛貢濟宇

(長春中醫藥大學，吉林長春130117)

摘要〔〕目的采用一測多評法同步測定丹參中5個主要成分的含量,為控制丹參藥材的質量提供方法。方法用超高效液相色譜法對丹參藥材進行分析，獲得丹參藥材的UHPLC色譜圖與相關數據；運用一測多評方法(SSDMC)，同時對丹參藥材中5種成分進行定量分析。結果對丹參藥材所建立的含量測定方法可在15 min內完成對其5個指標性成分的精確定量分析；且使用一測多評方法僅需要一個成分的標準品，即可進行定量分析。方法學考察結果均符合中藥質量標準研究制定技術要求。結論該研究建立了丹參藥材的UHPLC含量測定方法，從含量測定方面控制丹參藥材的質量。該研究建立的丹參含量測定方法簡單、快速、穩定且成本低廉。

關鍵詞〔〕一測多評法；超高效液相色譜；丹參；含量測定；中藥質量控制

第一作者：張晨(1987-)，女，碩士，主要從事藥物分析研究。

丹參具有祛瘀止痛、活血通經、清心除煩的功效，用于月經不調、經閉痛經、瘡瘍腫痛、心煩不眠、心絞痛等。丹參的有效成分分為脂溶性的二萜類成分和水溶性的酚酸類成分，中藥的多成分、多功效作用特點，決定著單一成分難以表達中藥質量〔1〕。近年來關于丹參水溶性成分及脂溶性成分含量測定的報道較多。但是這種多成分定量方法存在著對照品消耗量大，而且操作復雜、繁瑣的缺陷。對照品供應短缺限制了這些方法在科研、實際生產、市場監督中的應用?！耙粶y多評”方法的出現，在一定程度上解決了之前所遇到的難題。本實驗應用此方法展開丹參多指標多類成分質量控制的研究設想。即只測定其中1個脂溶性成分“丹參酮ⅡA”，通過建立該成分與其他成分的校正因子，同時計算3個脂溶性與3個水溶性成分的含量〔2～5〕。

1儀器與試劑

超高效液相色譜系統：Agilent 1290美國安捷倫科技公司〔配置高性能自動進樣器(G4226A)，二元泵(G4220A)，柱溫箱(G1316C)，可變波長檢測器(DAD G4212A)，Agilent ChemStationB.04.03版色譜工作站〕；BRANSON B3500S-DTH超聲波清洗儀，荷蘭必能信有限公司；Sartorius CP124S電子天平，北京賽多利斯有限公司；電子天平：Sartorius BT25S 北京賽多利斯有限公司。乙腈，磷酸為色譜純；丹參藥材購買于山東平邑；迷迭香酸對照品，紫草酸對照品購買于上海友思生物技術公司；丹酚酸B對照品：上海詩丹德生物技術有限公司(批號：STA-00511002)；丹參酮ⅡA對照品(批號：110766-200619)，隱丹參酮對照品(批號：110852-200806)，丹參酮Ⅰ對照品(批號：110867-200406)，均購買于中國藥品生物制品檢定所，超純水。

2方法與結果

2.1色譜條件色譜柱：Agilent ZORBAX Extend C18(2.1×100 mm，1.8 μm)；Agilent 1290 online-filter。流動相：乙腈(A)-0.05%磷酸(v/v)(B)；流速：0.4 ml/min；檢測波長：270 nm(4 nm)(參比波長:無)；進樣體積：2 μl；柱溫：25℃；采樣頻率：40 Hz。上述色譜條件下,各組分分離度良好,見表1，圖1。

表1梯度程序

時間(min)A(%)B(%)洗脫0~516~2784~73線性梯度5~627~6073~40線性梯度6~1260~6240~38線性梯度12~1562~7038~30線性梯度

1：迷迭香酸;2：紫草酸;3：丹酚酸B;4：隱丹參酮;5：丹參酮I;6：丹參酮ⅡA;7：未知峰 (1～6為所測成分)圖1　丹參樣品色譜圖

2.2檢測波長的選擇丹酚酸B與丹參酮ⅡA含量較高，且含量穩定，都可作為一測多評方法的對照品。但考慮到丹酚酸B對照品價格昂貴，且熱穩定性差，所以選取價格低廉，且穩定性好，色譜峰左右均無雜質峰的丹參酮ⅡA作為一測對照品，選取丹參酮ⅡA的最大吸收波長270 nm作為檢測波長。

2.3對照品溶液的制備對照品貯備液的配制：精密稱取迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ對照品及丹參酮ⅡA對照品適量，精密稱定，置10 ml棕色量瓶中，加甲醇制成每1 ml含迷迭香酸0.038 5 mg，含紫草酸0.076 0 mg，含丹酚酸B 0.903 0 mg，含隱丹參酮0.042 5 mg，丹參酮Ⅰ0.019 6 mg，丹參酮ⅡA 0.053 9 mg的溶液，即得。

2.4供試品溶液的制備取本品粉末(過五號篩)約0.15 g，精密稱定，置50 ml離心管中，精密加入甲醇15 ml，搖勻，超聲10 min，4 000 r/min離心5 min，傾出上清液至50 ml量瓶，藥渣繼續加入甲醇10 m，搖勻，超聲10 min，4 000 r/min離心5 min，傾出上清液至同一50 ml量瓶，重復提取3次；加甲醇溶液至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.22 μm)濾過，棄去2 ml初濾液，即得。

2.5方法學考察

2.5.1線性及線性范圍對照品溶液的制備：精密量取0.05、 0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml對照品貯備液，置于5 ml量瓶中，加甲醇溶劑稀釋至刻度。分別精密吸取各對照品溶液各2 μl，注入超高效液相色譜儀，按確立的色譜條件進行測定，記錄各峰峰面積。以對照品濃度(mg/ml)為橫坐標，峰面積為縱坐標，以最小二乘法進行線性回歸。見表2。

表25個指標成分的線性及線性范圍

名稱R線性范圍(μg)殘差平方和F(校正因子)迷迭香酸0.99990.00770~0.03851.3725.64紫草酸0.99990.00152~0.07602.8317.44丹酚酸B0.99990.0181~0.903560.2626.93隱丹參酮0.99990.000849~0.042529.6831.15丹參酮Ⅰ0.99990.000391~0.01964.8701.43丹參酮ⅡA1.00000.00108~0.053930.5651.00

2.5.2精密度實驗按供試品溶液制備方法，每天制備3份供試品溶液，連續分析3 d，得出迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ及丹參酮ⅡA的日間精密度RSD為1.02%、0.87%、0.85%、0.89%、0.98%和0.75%，且外標法與一測多評法的重復性精密度RSD一致，表明儀器精密度良好。

按供試品溶液制備方法，分別采用不同安捷倫超高效液相色譜系統，每個條件分析3份供試品溶液，得出迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ及丹參酮ⅡA的日間精密度RSD為1.02%、0.87%、0.85%、0.89%、0.98%和0.75%，且外標法與一測多評法的重復性精密度RSD一致，表明儀器精密度良好。

2.5.3穩定性實驗供試品溶液在室溫條件下放置 0、4、8、12、24 h后，迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ及丹參酮ⅡA的峰面積的RSD分別為1.32%、0.60%、0.62%、1.71%、1.14%和0.73%，表明處理后的樣品在24 h內穩定。

2.5.4重復性試驗采用3個不同濃度(高、中、低)，每個濃度各分別制備3份供試品溶液，連續進樣6次，測定，得出迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ及丹參酮ⅡA重復性的平均RSD分別為1.44%、0.59%、0.62%、0.87%、0.72%和0.65%，且外標法與一測多評法的重復性RSD一致，表明該方法的重復性好。

2.5.5加樣回收率按供試品溶液制備方法，制備9份供試品。稱取0.075 g丹參粉末，精密稱定，置50 ml具塞錐形瓶中，分別稱取2.26、4.52、6.78 mg丹酚酸B相當于供試品溶液中丹酚酸B含量的50%、100%、150%，分別精密加入相當于供試品溶液中迷迭香酸、紫草酸、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮ⅡA含量50%、100%和150%相應的混合對照品溶液15 ml，按供試品溶液制備方法制備，每個濃度制備3份，共9份供試品溶液。分別吸取2 μl注入超高效液相色譜儀，記錄峰面積，計算迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的含量。見表3。

表3加樣回收率試驗結果(n=3)

名稱水平外標法(%)一測多評(%)RSD(%)迷迭香酸低97.5695.991.42中97.3196.271.41高99.0598.180.59紫草酸低99.50100.621.24中100.29101.050.68高100.90101.530.14丹酚酸B低99.2695.280.23中100.7198.110.98高101.9199.710.79隱丹參酮低98.9198.381.49中101.36101.000.67高100.87100.570.61丹參酮Ⅰ低89.2157.180.91中83.1763.171.08高85.0368.720.50丹參酮ⅡA低96.9596.951.20中100.93100.930.46高100.75100.750.53

2.5.6校正因子計算采用獨立一次配制的8個系列混合對照品溶液的峰面積和相應濃度計算一測多評法中的校正因子，采用丹參酮ⅡA作為一測對照品(SSDMC)，從標準曲線中算得各對照品溶液斜率，校正因子通過斜率值算出，公式如下：Fi=SlopeⅡA/Slopei,Fi：校正因子(迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ)，SlopeⅡA：斜率值(丹參酮IIA-SSDMC)。Slopei：斜率值(迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ)。

2.6丹參含量測定見表4。

表4藥材含量測定試驗結果(n=3)

名稱外標法水平稱樣量(g)含量(%)RSD(%)一測多評法水平稱樣量(g)含量(%)RSD(%)迷迭香酸低0.07530.2661.52低0.07530.2681.52中0.14990.2590.80中0.14990.2610.80高0.22450.2571.99高0.22450.2591.99平均值0.14990.2611.44平均值0.14990.2631.44紫草酸低0.07530.4630.25低0.07530.4700.25中0.14990.4600.06中0.14990.4670.06高0.22450.4551.46高0.22450.4631.46

續表4藥材含量測定試驗結果(n=3)

名稱外標法水平稱樣量(g)含量(%)RSD(%)一測多評法水平稱樣量(g)含量(%)RSD(%)平均值0.14990.4590.59平均值0.14990.4670.59丹酚酸B低0.07536.0900.31低0.07536.0220.31中0.14996.0200.17中0.14995.9540.17高0.22455.9681.40高0.22455.9021.40平均值0.14996.0260.62平均值0.14995.9600.62隱丹參酮低0.07530.2530.60低0.07530.2550.60中0.14990.2550.82中0.14990.2570.82高0.22450.2551.20高0.22450.2561.20平均值0.14990.2540.87平均值0.14990.2560.87丹參酮Ⅰ低0.07530.1250.63低0.07530.1140.63中0.14990.1330.40中0.14990.1210.40高0.22450.1371.14高0.22450.1251.14平均值0.14990.1320.72平均值0.14990.1200.72丹參酮ⅡA低0.07530.3290.53低0.07530.3290.53中0.14990.3320.35中0.14990.3320.35高0.22450.3321.09高0.22450.3321.09平均值0.14990.3310.65平均值0.14990.3310.65總含量低0.07537.5260.28低0.07537.4590.28中0.14997.4590.18中0.14997.3920.18高0.22457.4041.39高0.22457.3371.39平均值0.14997.4630.62平均值0.14997.3960.62

3討論

有研究者對試驗條件分別進行了考察：丹參酮Ⅰ對照品很難溶解于甲醇水溶液中，所以為后期實驗考慮，采用甲醇作為提取溶劑；丹酚酸B成分在高溫下不穩定，會產生一定程度的降解，所以選擇超聲提取法為供試品提取方法；在此基礎上分別考察了提取溶劑體積，提取次數以及提取時間；流動相酸度流動相酸度可以在0.04%～0.06%調節，系統適用性參數受流動相酸度影響很??；降低流動相中乙腈比例，可以改善部分分離度。酚酸類成分在調整乙腈比例時，相對保留時間波動較大〔6～8〕超過2.0%；但含量合計的相對標準偏差小于2.0%，因此建議流動相中乙腈比例不宜變動過大；檢測波長變動對相對保留時間，系統適用性參數影響很??；對一測多評含量影響較大。因此一測多評法中，應嚴格控制檢測波長為270 nm；流速對含量影響較小，相對標準偏差小于2.0%。對系統適用性參數，降低與升高流速可以提高理論板數。流速對相對保留時間影響較大，相對標準偏差超過2.0%。因此一測多評法中，應當控制流速；柱溫對相對保留時間有較大影響，RSD較大；對含量無影響，相對標準偏差小于2.0%。

對于一測多評法，檢測波長，流動相比例，柱溫和流速應與標準設定一致。流動相酸度，進樣體積、梯度時間可以適當調整，以改善系統適用性參數〔9〕。

基于耐用性結果：系統適用性參數應確定為重復進樣的RSD小于2.0%；迷迭香酸與紫草酸，隱丹參酮與其前一個雜質峰，隱丹參酮與丹參酮Ⅰ的分離度不小于1.5；對稱因子大于0.5，小于1.5；丹參酮ⅡA理論板數應大于70 000。

將“一測多評”法用于含迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ及丹參酮ⅡA成分的多指標質量評價，通過大量的實驗建立了6種指標性成分間的相對校正因子，對“一測多評”法的藥材質量評價方式進行了探索性研究，結果證明采用“一測多評”法建立主要成分之間的相對校正因子對藥材質量進行準確、經濟的控制是可行的。

參考文獻4

1李倩，劉偉，羅祖良，等.一測多評法測定丹參中丹參酮IIA、隱丹參酮、丹參酮I、二氫丹參酮I的含量〔J〕.中國藥學雜志,2012；37(6):824.

2Cheng HT,Li XL,Li XR,etal.Simultaneous quantification of selected compounds from Salvia herbs by HPLC method and their application〔J〕.Food Chem,2012;130:1031-5.

3Yuan JP,Chen H,Chen F.Simultaneous determination of rosmarinic acid,lithospermic acid B,and related phenolics in salvia miltiorrhiza by HPLC〔J〕.J Agric Food Chem,1998;46:2651-4.

4Zhong GX,Li P,Zeng LJ,etal.Chemical characteristics of salvia miltiorrhiza(Danshen)collected from different locations in China〔J〕.J Agric Food Chem,2009;57:6879-87.

5Hou JJ,Wu WY,Da J,etal.Ruggedness and robustness of conversion factors in method of simultaneous determination of multi-components with single reference standard〔J〕.J Chromatoqr A,2011;1218(33):5618-27.

6宋麗萍.一測多評法測定茵陳中4種酚酸類成分含量〔J〕.中藥材,2015;38(4):774-6.

7劉瀟瀟,楊立偉,歐國燈,等.一測多評法在復方丹參片皂苷類成分檢測中的應用研究〔J〕.中國新藥雜志,2014；23(21):2561-7.

8王智民,高慧敏,付雪濤,等.“一測多評”法中藥質量評價模式方法學研究〔J〕.中國中藥雜志，2006；31(23):1925.

9王智民，錢忠直，張啟偉，等.一測多評法建立的技術指南〔J〕.中國中藥雜志，2011;36(6):657.

〔2015-02-11修回〕

(編輯曲莉)

通訊作者：貢濟宇(1960-)，女，教授，主要從事藥物分析研究。

基金項目：吉林省科技發展計劃項目(20130727020YY)

中圖分類號〔〕R917〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)24-7015-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.022