發酵蘋果汁的抗氧化性能變化

葉盼，吳慧，王德純，趙黎明，蔣麗華*

1(華東理工大學 生物工程學院發酵工業分離提取技術研發中心，生物反應器工程國家重點實驗室，上海，200237)2(杜邦營養與健康中心(原丹尼斯克(中國)有限公司)，上海，200335)

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發酵蘋果汁的抗氧化性能變化

葉盼，吳慧2，王德純2，趙黎明1，蔣麗華1*

1(華東理工大學 生物工程學院發酵工業分離提取技術研發中心，生物反應器工程國家重點實驗室，上海，200237)2(杜邦營養與健康中心(原丹尼斯克(中國)有限公司)，上海，200335)

摘要選取植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)對蘋果汁進行發酵，以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基清除能力，2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸二銨鹽) (2,2′-amino-di(2-ethyl-benzothiazolin esulphonic acid-6)ammonium salt，ABTS)自由基清除能力以及鐵離子還原能力為指標，考察了發酵后蘋果汁抗氧化性能的變化，并測定其總酚和總黃酮含量。結果表明，發酵后蘋果汁的抗氧化活性較發酵前有所提高。發酵第9天，蘋果汁的DPPH和ABTS自由基清除能力最強，較發酵前分別提高了(35.3±3.3)%和(64.9±3.5)%。而發酵第5天蘋果汁的鐵離子還原能力最強，比發酵前提高了(37.4±3.7)%。發酵后蘋果汁的總酚含量出現明顯變化，發酵第9天總酚含量達到最大值，比發酵前增加了(52.1±9.6)%。發酵后蘋果汁的總黃酮含量呈下降趨勢，發酵至第23天，其含量比發酵前降低了(17.9±6.6)%。經相關性分析可知，發酵蘋果汁的總酚含量與DPPH清除能力呈顯著正相關，與ABTS清除能力和還原能力之間相關性不高。

關鍵詞抗氧化活性；植物乳桿菌；蘋果汁；總酚；總黃酮

近年來，由臺灣地區、日本等地興起的酵素飲料風靡東南亞。這類以果蔬為基質，通過益生菌發酵而得的果蔬飲料也因此受到廣泛的關注。果蔬發酵飲料種類豐富，常根據發酵時間、使用果蔬基質以及益生菌的不同而不同。常用的益生菌有醋酸菌、乳酸菌以及酵母等。

乳酸菌作為一類最廣泛使用的益生菌，早期用于發酵乳類食品[1]?，F在人們也逐漸將它應用于果汁或蔬菜汁中，如YOON[2]等人比較了不同乳酸菌發酵的卷心菜汁，得到了一種風味良好的卷心菜發酵飲料。DEMIR[3]等以胡蘿卜為基質，探討了接種量對發酵胡蘿卜汁的影響，確定了最佳接種量，并得到口感良好的胡蘿卜汁發酵飲料。隨著發酵工藝的研究日益完善，人們開始將注意力轉移到發酵果蔬飲料的生理功能上。ANKOLEKAR[4]等通過實驗發現嗜酸乳桿菌發酵的梨汁具有潛在的降糖作用。SIMSEK[5]等人比較蔬菜汁發酵前后的諸多生理功能變化，結果表明發酵后蔬菜汁具有較好的降壓效果。

蘋果是人們日常生活中最常見、消費最多的水果之一，也是日常飲食中外源性抗氧化物質的主要來源[6-7]?？茖W研究表明，適量的補充抗氧化食品是清除人體自由基，增強抗氧化防御系統，延緩衰老，預防疾病的最佳保健方法[8]。

本文選用了植物乳桿菌對蘋果汁進行發酵，通過測定蘋果汁中pH，固形物含量及生物量等指標，觀察菌種在發酵過程中的生長變化。分析發酵過程中蘋果汁對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸二銨鹽) (2,2'-amino-di(2-ethyl-benzothiazolin esulphonic acid-6)ammonium salt，ABTS)自由基的清除能力及鐵離子的還原能力，期望為乳桿菌在果汁發酵飲品中的進一步開發應用提供一定的理論基礎和技術依據。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，2, 2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)，三吡啶基三吖嗪(TPTZ)，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)，3-叔丁基-4-羥基苯甲醚(BHA)：TCI化成工業發展公司；蘆丁，水溶性維生素E(Trolox)：西格瑪奧德里奇貿易有限公司；抗壞血酸(VC)，福林酚試劑，K2S2O8，Na2CO3，NaNO2，Al(NO3)3，NaOH，無水乙醇：化學純，國藥集團化學試劑有限公司；沒食子酸一水，三氯化鐵，醋酸鈉，冰醋酸：化學純，上海凌峰化學試劑有限公司。

1.2儀器與設備

CP214C電子天平(0.000 1 g)，Sout SE電子天平(0.01 g)，奧豪斯儀器(上海)有限公司；高速大容量離心機5810R，艾本德中國有限公司；電熱恒溫水浴鍋DK-S24，上海精宏實驗設備有限公司；UV-2000紫外分光光度計，尤尼克上海儀器有限公司；FE20精密pH計，梅特勒-托利多儀器有限公司；PAL-LOOP迷你數顯折射器，ATAGO(愛拓)中國分公司；移液槍，Dragon Lab；DHP-9162電熱恒溫培養箱，上海齊欣儀器科技有限公司；MJ-25BM02C攪拌機，廣東美的精品電器制造有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1蘋果汁發酵

本實驗所用植物乳桿菌為直投式菌粉，由杜邦營養與健康中心提供。

將新鮮的富士蘋果去皮、去核，與去離子水按體積比1∶1榨汁。用食用堿(Na2CO3)調節蘋果汁pH值至6.5左右后于65 ℃下殺菌35 min。待果汁冷卻，接種，接種量為107CFU/mL。于35 ℃下恒溫發酵，定期觀察取樣。樣品于轉速4 000 r/min離心10 min，得上清液，于-4 ℃下冷凍保存，待用。

1.3.2pH、固形物含量以及生物量的測定

(1)pH測定：使用FE20 精密pH計測定。

(2)固形物含量(Brix)：使用PAL-LOOP迷你數顯折射器測定。

(3)生物量測定[9]：通過比濁法測定OD值來表征發酵果汁的生物量。將樣品與去離子水按體積比1∶10稀釋，以去離子水為空白，測其在590 nm波長下的OD值。每個樣品平行測定3次。

1.3.3生物活性物質測定

總酚的測定：福林酚法[10]。取0.1 mL樣品用去離子水1∶1稀釋，與體積分數50%的福林酚溶液混合均勻。5 min后，加入2 mL質量分數7.5%的Na2CO3，避光條件下反應30 min，于760 nm波長下測吸光值。以沒食子酸(Gallic acid)為標準品，制作標準曲線。果汁中總酚的含量表示為：1 L果汁中含有的GAE(gallic acid equivalent)的質量(mg)，計為mg/L。每個樣品平行測定3次。

總黃酮的測定：主要參考ABIRAMI等[11]報道的方法。1 mL樣品中加入4 mL去離子水和0.3 mL質量分數5%的NaNO2，混勻放置5 min。加入0.3 mL質量分數10%的Al(NO3)3，反應6 min，加入2 mL 1 mol/L NaOH終止反應，加水定量至10 mL，于510 nm波長下測吸光值。以蘆丁(rutin)為標準品，作標準曲線。果汁中總黃酮的含量表示為：1 L果汁中含有的rutin的質量，計為mg/L。每個樣品平行測定3次。

1.3.4抗氧化活性

DPPH清除能力：參考AABIRAMI等[11]報道的方法。0.1 mL樣品中加入3.9 mL 0.025 g/L DPPH溶液，常溫下避光反應30 min，于515 nm波長下測吸光值。0.1 mL無水乙醇和3.9 mL DPPH溶液混合作為空白對照。水溶性維生素E(Trolox)，BHA，BHT，VC等抗氧化劑為陽性對照。每個樣品平行測定3次。

DPPH自由基的清除率由公式(1)計算而得：

(1)

式中:A0，對照樣品吸光度值；A1，待測樣品吸光度值。

ABTS清除能力：主要參考HUANG等[12]所報道的方法。配制7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液，混合后避光放置12～16 h，獲得ABTS自由基引發液。用無水乙醇稀釋ABTS自由基引發液，于734 nm處，吸光值達到0.7左右方可使用。取0.1 mL樣品和3.9 mL ABTS溶液，室溫下反應10 min，734 nm波長下測吸光值。0.1 mL無水乙醇和3.9 mL ABTS反應液作為空白對照。Trolox，BHA，BHT，VC為陽性對照。每個樣品平行測定3次。

ABTS自由基的清除率由公式(2)計算而得：

(2)

式中:A0,對照樣品吸光度值；A1,待測樣品吸光度值。

鐵離子還原能力(FRAP)：主要參考BENZIE等[13]的方法。用去離子水1∶1稀釋0.5 mL樣品，與3 mL TPTZ工作液充分混合，37 ℃下反應4 min，于593 nm波長處測吸光度。TPTZ工作液由醋酸緩沖液(pH=3.6)，10 mmol/L的TPTZ溶液(用40 mmol/L的HCl配置)，FeCl3溶液(20 mmol/L)按10∶1∶1的比例混合所得。以Trolox為標準品，作標準曲線。BHA，BHT，VC為陽性對照。果汁的鐵離子還原能力表示為mg(Trolox)/L(果汁)。每個樣品平行測定3次。

1.4數據統計與分析

實驗數據以實驗平均值±標準差(SD)的形式表示。使用單因素方差分析，LSD法和Duncan等多重方法對數據進行比較，其中P<0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著。

2結果與分析

2.1發酵蘋果汁pH，固形物含量以及OD值的變化

發酵前蘋果汁和發酵3，5，7，9，16 d以及23 d蘋果汁的pH，固形物含量以及生物量如圖1所示。發酵到第5天，蘋果汁pH值從6.55快速降低至3.88，之后略有下降，但無明顯變化。在發酵期間固形物含量整體呈下降趨勢，但變化不顯著。OD值一直呈上升趨勢，前期上升較快，后期變平緩。乳桿菌發酵過程中有機酸大量生成[14]，會導致pH下降。當pH穩定不再降低，乳桿菌的發酵或將變緩，此時可做為發酵終點。實驗中所得發酵蘋果汁風味狀態均良好，發酵過程穩定。

圖1　發酵過程中pH，固形物含量和OD值的變化Fig.1　Changes in pH, Brix and OD value during fermentation

2.2發酵蘋果汁的抗氧化活性

目前常用的體外測定抗氧化能力的方法主要基于樣品對檢測體系中自由基的清除能力和對鐵離子的還原能力[15]等機理。本文分別選取了DPPH法，ABTS法以及FRAP法來檢測樣品的自由基清除能力和鐵離子還原能力。

2.2.1DPPH清除能力

發酵不同時間的蘋果汁和0.1 mg/mL BHA、BHT、VC以及Trolox對DPPH自由基的清除率如圖2所示。發酵后蘋果汁DPPH自由基清除率均高于發酵前，且在發酵前期呈逐漸上升趨勢，隨后降低。發酵到第9天蘋果汁DPPH清除率最高，比未發酵蘋果汁高出(35.3±3.3)%。發酵后蘋果汁的DPPH清除率均高于4種抗氧化劑，且具有顯著性差異(P<0.05)。

圖2　發酵過程中DPPH自由基清除能力的變化Fig.2　Changes in DPPH radical scavenging ability during fermentation

2.2.2ABTS清除能力

發酵不同時間的蘋果汁對ABTS自由基的清除率如圖3所示。發酵后蘋果汁ABTS自由基清除率均高于發酵前，與DPPH自由基清除能力的變化相似，發酵前期呈逐漸上升趨勢，隨后下降，趨于平緩。發酵第9 d的蘋果汁ABTS自由基清除率最高，比發酵前提高了(64.9±3.5)%，僅次于0.1 mg/mL VC溶液。

圖3　發酵過程中ABTS自由基清除能力的變化Fig.3　Changes in ABTS radical scavenging ability during fermentation

2.2.3鐵離子還原能力(FRAP)

抗氧化能力的表達方式主要有TEAC(Trolox equivalent antioxidant capacity)，抑制率以及半抑制系數等[16]。鐵離子還原能力的表達通常采用TEAC的方式。以Trolox(0～0.1 mg/mL)為標準品，繪制標準曲線，標準曲線回歸方程為：y=16.358x-0.040，R2=0.997。

發酵前后蘋果汁的鐵離子還原能力如圖4。發酵后蘋果汁的鐵離子還原能力均高于發酵前。發酵前5 d，蘋果汁的鐵離子還原能力呈上升趨勢，隨后緩慢下降。發酵第5 d的蘋果汁的鐵離子還原能力最強，比發酵前提高了(37.4±3.7)%，與0.1 mg/mL VC還原能力相當，且無顯著差異(P>0.05)。

圖4　發酵過程中鐵離子還原能力的變化Fig.4　Changes in reducing power during fermentation

綜合以上3種抗氧化評價體系的結果可知，發酵后蘋果汁的DPPH自由基清除能力，ABTS自由基清除能力以及鐵離子還原能力均高于發酵前，且在發酵第5至9 d內達到較高峰值。與一定濃度的抗氧化劑相比，發酵蘋果汁具有良好的抗氧化性能。

2.3發酵過程中總酚和總黃酮的變化

蘋果多酚是蘋果的主要抗氧化物質之一，按其酸堿性可分為：酚酸和中性黃酮類物質兩大類[17]。本文采用福林酚法和ABIRAMI等[11]報道的方法分別測定蘋果汁總酚和總黃酮含量如圖5所示。

圖5　發酵過程中總酚和總黃酮含量變化Fig.5　Changes in total phenolic compounds and flavonoids during fermentation

發酵過程中，蘋果汁的總酚含量呈先降低再升高后緩慢降低的趨勢。發酵第9天其含量達到最高，由發酵前的(67.7±4.3) mg/L增加到(103.1±11.3) mg/L，發酵前后增加了(52.1±9.6)%。而果汁中總黃酮含量呈緩慢下降趨勢。發酵至23 d，總黃酮含量由發酵前的(80.2±4.2) mg/L降低到(68.0±0.6) mg/L，發酵前后降低了(17.9±6.6)%。

引起果汁中總酚含量變化的原因諸多，如酚類物質會與果汁中蛋白結合，形成大分子聚合物，使得總酚含量降低[18]。而在發酵過程中，一定濃度的酚類物質會產生抑菌作用，乳酸菌為保持生長會降解酚類物質，這種“自我解毒”行為會使總酚含量降低[19-20]。同時，CHU[21]等人的研究表明，發酵過程中微生物會把復雜的大分子酚類物質轉化成小分子酚類物質，從而使總酚含量增加。因此，發酵蘋果汁中總酚含量的變化，不僅與果汁自身的物理化學性狀有關，也與微生物的作用相關。關于總黃酮含量在發酵過程中的變化機理，目前尚未見詳細報道，有待于進一步探究。

2.4發酵蘋果汁總酚總黃酮含量與抗氧化活性相關性分析

通過對發酵蘋果汁的總酚含量與抗氧化活性進行相關性分析，得表1。由表1可知，發酵后蘋果汁的DPPH自由基清除能力與總酚含量具有顯著正相關，r=0.757(P<0.05)。ABTS自由基清除能力和鐵離子還原能力與總酚含量的相關性不高，相關系數分別為r=0.656(P>0.05)，r=0.358(P>0.05)。而對樣品中總黃酮含量與抗氧化活性進行相關性分析可得，發酵后蘋果汁的DPPH、ABTS自由基清除能力以及鐵離子還原能力與總黃酮含量基本不呈線性相關，相關系數分別為r=0.170(P=0.715>0.05)；r=0.319(P=0.486>0.05)；r=0.256(P=0.580>0.05)。

表1　抗氧化性能與總酚含量的相關性

SHAHIDI等[22]人曾報道酚類物質的增加很可能是DPPH自由基清除能力提高的重要原因，認為酚類物質很容易給出1個H+，通過與DPPH自由基共振雜化而形成穩定物質。EREL等[23]人研究也表明，高濃度的酚類物質具有較高的ABTS自由基清除能力。但是，它們之間的作用還取決于分子質量、芳香環的數量和羥基取代基的性質[24]。因此，蘋果汁在植物乳桿菌發酵過程中抗氧化活性的提高除了與酚類物質的含量有關，也可能與發酵過程中微生物的作用下酚類物質的相互轉化有關。

3結論

本文通過植物乳桿菌發酵蘋果汁，研究了蘋果汁抗氧化性能的變化。結果表明，發酵后蘋果汁的抗氧化性能得到了提高，總酚含量有所增加，其DPPH自由基清除能力，ABTS自由基清除能力以及鐵離子還原能力均高于發酵前，且在發酵第5～9天達到最大的抗氧化活力。本研究為闡明發酵果蔬飲料的生理功能提供了一定的理論基礎，也為發酵果蔬飲料的綜合開發利用提供了一定的科學依據。

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Changes on antioxidant activity of fermented apple juice

YE Pan1, WU Hui2, WANG De-chun2, ZHAO Li-ming1, JIANG Li-hua1*

1(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, R&D Center of Separation and Extration Technology in Fermentation Industry,School of Biotechnology of East China University of Science and Technology, Shanghai 200237,China) 2(DuPont Nutrition & Health (Danisco (China) Co. Ltd.), Shanghai 200335,China)

ABSTRACTResearch was undertaken to determine the changes on antioxidant activity of apple juice (AJ) fermented by Lactobacillus plantarum. Scavenging activity on DPPH (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl) radical, ABTS (2,2′-amino-di(2-ethyl-benzothiazolin esulphonic acid-6) ammonium salt) radical and ferric reducing power were investigated, while the contents of total phenolic compounds and flavonoids were measured. The results showed that the antioxidant activity of fermented AJ increased, compared with the beginning of fementation. AJ fermented after 9 days had the strongest scavenging activity on DPPH radical and ABTS radical, which increased by (35.3±3.3)% and (64.9±3.5)%, respectively. The ferric reducing power of AJ reached the highest after fermentation for 5 days, which increased 37.4(±3.7)% compared with unfermented AJ. The content of phenolic compounds had remarkable changes during fermentation and reached the highest after 9 days, which increased by (52.1±9.6)%. The content of flavonoids reduced during fermentation and decreased 17.9(±6.6)% after 23 days. The results from correlation analysis showed that the content of total phenolic compounds in fermented AJ had a significantly positively correlation with DPPH radical scavenging activity, but was not highly relevant to ABTS radical scavenging activity and ferric reducing power.

Key wordsantioxidant activity; Lactobacillus plantarum; apple juice; total phenolic compounds; total flavonoids

收稿日期：2015-10-09，改回日期：2015-12-18

基金項目：國家自然科學基金(31371725)；國家863計劃項目(2014AA021202)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201604021

第一作者：碩士研究生(蔣麗華教授為通訊作者,E-mail：lhjiang@ecust.edu.cn)。