干預腎素-血管緊張素-醛固酮系統不同環節對單側輸尿管梗阻大鼠腎組織的影響*

韓曉慶　孫建平　李娜　崔萌　張寧　劉逸凡

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干預腎素-血管緊張素-醛固酮系統不同環節對單側輸尿管梗阻大鼠腎組織的影響*

韓曉慶①孫建平①李娜②崔萌①張寧①劉逸凡①

【摘要】目的：觀察干預腎素-血管緊張素-醛固酮系統不同環節對單側輸尿管梗阻大鼠腎組織的影響。方法：選取6周齡SD大鼠50只作為研究對象，隨機分為正常組、模型組、依那普利組、纈沙坦組及螺內酯組，每組10只。采用單側輸尿管梗阻（UUO）大鼠模型，正常組和模型組于造模前24h-造模后14d給予0.9%氯化鈉溶液10mL/（kg·d）灌胃，依那普利組、纈沙坦組及螺內酯組分別于造模前24h-造模后14d給予依那普利10mg/（kg·d）、纈沙坦10mg/（kg·d）、螺內酯100mg/（kg·d）灌胃。各組大鼠均于造模后2周處死，收集血、尿標本進行生化檢測，腎組織行HE染色及逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）法觀察梗阻腎組織TGF-β1mRNA、血管緊張素原（AGT）mRNA、血管緊張素轉化酶（ACE）mRNA、醛固酮（ALD）mRNA的表達。結果：與正常組比較，模型組、依那普利組、纈沙坦組及螺內酯組的血肌酐、尿素氮均不同程度增高，以模型組升高最為明顯，比較差異均有統計學意義（P＜0.05），依那普利組、纈沙坦組及螺內酯組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）；五組間24h尿蛋白比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；依那普利組、纈沙坦組及螺內酯組腎間質損傷指數均高于正常組，但低于模型組，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論：阻斷腎素-血管緊張素-醛固酮系統不同環節均具有抑制大鼠腎間質纖維化的作用，且其效果相近。

【關鍵詞】腎間質纖維化；腎素-血管緊張素-醛固酮系統；大鼠

①青島大學附屬醫院山東青島266003

②山東省青島市第八人民醫院

First-author’s address：The Affiliated Hospital of Qingdao University，Qingdao 266003，China

腎間質纖維化是由腎間質成纖維細胞增殖和細胞外基質在腎間質內過度沉積所導致，是慢性腎臟病發展的最終結果，是導致終末期腎功能衰竭的主要原因之一。腎功能的惡化，主要取決于腎小管間質纖維化的程度［1］。研究表明，腎素-血管緊張素-醛固酮系統（renin-angiotensin-aldosteronesystem，RAAS）尤其是血管緊張素Ⅱ（AngⅡ），不僅在調節血流動力學而且在腎間質纖維化中起重要作用［2］。大量實驗表明，ACEI、ARB及醛固酮拮抗劑均可延緩腎間質纖維化的進展，然而這三類藥物抗腎間質纖維化的療效是否相近或其中某類藥物抗腎間質纖維化的效果更顯著目前還未見報道［3-5］。本實驗應用依那普利、纈沙坦及螺內酯分別阻斷RAAS不同環節，觀察其抗腎間質纖維化的作用，現報道如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物6周齡健康雄性SD大鼠50只，體重160～200g，清潔級。

1.2藥物與試劑馬來酸依那普利（揚子江藥業集團江蘇制藥股份有限公司，批號：國藥準字H32026568），纈沙坦（北京諾華制藥有限公司，批號：國藥準字H20040217），螺內酯（海南海神同洲制藥有限公司，批號：國藥準字H46020690）。TRIzol（lifetechnologies），FastQuantcDNA第一鏈合成試劑盒（北京天根），SuperReal熒光定量預混試劑（北京天根）。

1.3方法

1.3.1分組和建模50只健康雄性SD大鼠隨機分為正常組、模型組、依那普利組、纈沙坦組和螺內酯組，每組10只。模型組、依那普利組、纈沙坦組及螺內酯組大鼠用10%水合氯醛（3mL/kg）腹腔注射麻醉，仰臥位固定，75%乙醇消毒，腹部正中左側縱行切口，分離左側輸尿管，于中上1/3處結扎并剪斷輸尿管，使左側腎臟完全梗阻，逐層縫合，正常組大鼠打開腹腔后只分離但不結扎和剪斷輸尿管。術后腹腔注射青霉素（10U/d，連續3d），造模前24h-造模后14d，依那普利組用血管緊張素轉化酶抑制劑依那普利10mg/（kg·d），纈沙坦組用血管緊張素Ⅱ的Ⅰ型受體拮抗劑纈沙坦10mg/（kg·d），螺內酯組用醛固酮受體拮抗劑螺內酯100mg/（kg·d）灌胃，正常組和模型組用2mL/d0.9%氯化鈉溶液灌胃。

1.3.2腎組織標本采集造模后14d處死所有大鼠，快速取出左腎，去除包膜，用0.9%氯化鈉溶液將左腎積存的血液沖洗干凈，按冠狀位縱行剖開，一半腎組織置于4%甲醛固定液固定，用于HE染色；另一半腎組織快速置于-80℃低溫冰箱保存，用于RT-PCR［6］。

1.3.3腎功能指標檢測造模后13d（處死前1d），將大鼠置于代謝籠，留取大鼠24h尿液，送檢驗科檢測24h尿蛋白定量。造模后14d處死所有大鼠，經腹主動脈采血5mL，室溫靜置1h，3000r/min，4℃離心15min，取上層血清檢測血清Scr、BUN。

1.3.4腎組織病理檢查腎組織標本用4%甲醛固定液固定，常規脫水，石蠟包埋，切片4μm，行HE染色，光鏡觀察腎小球、腎小管的病理變化及炎癥細胞浸潤的情況。按腎間質損傷8項指標評分：腎小管上皮細胞空泡變性、腎小管擴張、腎小管萎縮、紅細胞管型、蛋白管型、間質水腫、間質纖維化、間質細胞浸潤，計算其均值，作為該標本的腎小管間質損傷指數［7］。

1.3.5腎組織TGF-β1、AGT、ACE、ALDmRNA檢測采用RT-PCR法，TRIzol提取腎組織總RNA，按TRIzol說明書步驟提取。用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA，取4μL cDNA為模板按PCR試劑盒說明進行PCR擴增，總體系為20μL，以GAPDH為內參，引物及內參序列由上海生工設計及合成。引物序列：TGF-β1：上游5’CTTTGTACAGCACCCGC3’，下游5’TAGATTGCGTTGCGGTC3’；AGT：上游5’CTGGAGCTAAAGGACACACAGA3’，下游5’GTGGATGTATACGCGGTCCC3’；ACE：上游5’GCTTGACCCTGGATTGCAGC3’，下游5’CTCCGTGATGTTGGTGTCGT3’；ALD：上游5’GAAGTTCGATCTGGGGCCAA3’，下游5’AGGGTCATATAGGGTCGCTGA3’；GAPDH：上游5’GGCAAGTTCAACGGCACAGT3’，下游5’AAGACGCCAGTAGACTCCACG3’。

1.4統計學處理采用SPSS19.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（±s）表示，比較采用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組腎功能指標檢測結果比較各組大鼠24h尿蛋白比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；模型組、依那普利組、纈沙坦組及螺內酯組肌酐、尿素氮均較正常組升高，其中模型組升高最為明顯，依那普利組、纈沙坦組及螺內酯組間比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1　各組大鼠腎功能指標檢測結果（±s）

表1　各組大鼠腎功能指標檢測結果（±s）

*與正常組比較，P＜0.05；△與模型組比較，P＜0.05

組別　24　h尿蛋白（mg/d）肌酐（μmol/L）尿素氮（mmol/L）正常組（n=10）　12.39±8.23　63.33±5.79　　　8.54±1.46模型組（n=10）　　9.28±5.01　75.00±5.18*　11.32±0.68*依那普利組（n=10）　8.62±5.60　70.20±2.49*△　10.14±1.19*△纈沙坦組（n=10） 17.14±8.95　70.17±1.72*△　　　9.93±0.72*△螺內酯組（n=10） 14.65±8.68　68.00±3.06*△　　　9.91±1.03*△

2.2各組腎臟組織病理改變結果比較光鏡顯示正常組大鼠腎小球、腎小管及間質大小或形態結構均正常；模型組腎間質大量炎癥細胞浸潤，間質間隙增寬，細胞外基質成分增多，并可見腎小管上皮細胞水腫、變性、壞死，管腔內可見脫落壞死的上皮細胞，腎小管擴張；依那普利、纈沙坦及螺內酯組上述病理改變明顯減輕，見圖1。與正常組的腎間質損傷指數（1.67±0.58）比較，模型組（6.00±1.00）、依那普利組（3.67±0.58）、纈沙坦組（4.00±1.00）及螺內酯組（3.66±1.15）均有不同程度地升高，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，依那普利組、纈沙坦組及螺內酯組腎間質損傷指數均不同程度地降低，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。

圖1　腎臟病理HE染色（×200）注:A正常組；B模型組；C依那普利組；D纈沙坦組；E螺內酯組

2.3各組大鼠TGF-β1mRNA、AGTmRNA、ACE mRNA、ALDmRNA的表達結果RT-PCR結果顯示，輸尿管結扎后大鼠腎臟TGF-β1mRNA、AGTmRNA、ACEmRNA及ALDmRNA表達均較正常組有不同程度地增加。依那普利組、纈沙坦組及螺內酯組TGF-β1mRNA、AGTmRNA、ACE mRNA、ALDmRNA的表達較模型組大鼠明顯減少（P＜0.05），但三組間比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖2　各組大鼠TGF-β1mRNA、AGT mRNA、ACE mRNA及ALD mRNA的表達

3　討論

腎間質纖維化是以腎小管萎縮或擴張，腎間質炎性細胞浸潤，成纖維細胞形成與積聚及細胞外基質在腎間質中過度沉積為特征的不可逆的發展過程［8］。腎間質的病變程度是決定10年腎臟存活率最重要的影響因素，對腎臟疾病預后的影響較腎小球病變更為重要［9］。UUO模型是以進行性腎間質纖維化為特征的實驗性腎病模型，持續輸尿管梗阻引起的慢性炎癥和間質纖維化可導致腎功能的進行性喪失［10］。

目前研究認為，腎間質纖維化是各種細胞、細胞因子及炎癥因子相互作用，導致細胞外基質代謝失衡，在腎間質異常集聚所致，其中轉化生長因子β1（transforminggrowthfactorβ1，TGF-β1）是促進細胞增殖和間質纖維化的重要因子［11］。大量的動物實驗和臨床研究表明，腎小管上皮細胞、成纖維細胞及系膜細胞等腎臟固有細胞TGF-β1表達上調通常與腎間質纖維化密切相關。作為一種強效的致纖維化因子，TGF-β1在腎間質纖維化的發生發展中起重要作用。TGF-β1主要的致纖維化作用表現在：（1）可趨化炎癥細胞在腎間質浸潤，促使腎小管上皮細胞轉化為成纖維細胞，進而產生大量的細胞外基質；（2）抑制多種細胞外基質降解酶的活性，促進金屬蛋白酶組織抑制因子-l及纖溶酶原激活抑制因子-1的表達，抑制細胞外基質的降解；（3）增加ECM的受體如整合素的表達，從而增加ECM與細胞的相互作用［12-14］。本實驗結果顯示，模型組、依那普利組、纈沙坦組及螺內酯組的TGF-β1表達較正常組明顯增加，但依那普利組、纈沙坦組及螺內酯組的TGF-β1表達較模型組又明顯降低，表明TGF-β1在腎間質纖維化的過程中起促進作用，且依那普利（ACEI）、纈沙坦（ARB）及螺內酯（醛固酮拮抗劑）對腎間質纖維化有一定的防治作用。

腎素-血管緊張素-醛固酮系統（RAAS）是人體內重要的體液調節系統，RAAS除了存在于循環系統中，還存在于許多組織器官中，如心臟、腎臟、腎上腺等，稱為局部RAAS，其主要與組織纖維化和/或重構過程有關。研究表明，隨著腎臟的受損，可觀察到RAAS的成分如血管緊張素原、血管緊張素轉換酶、血管緊張素I和血管緊張素Ⅱ的上調或重新分布。腎臟局部RAAS在腎間質纖維化的形成中具有重要的促進作用，其效應分子血管緊張素Ⅱ（Ang-Ⅱ）和醛固酮是重要的致炎因子，可促進成纖維細胞增殖和細胞外基質的合成，促進腎間質纖維化［15］。AngⅡ是RAAS的主要生物活性成分，是一種重要的細胞因子，具有多重生理學效應，可通過誘導細胞因子、生長因子和黏附分子等的表達發揮其促纖維化作用［16］。有研究表明，AngⅡ可激活腎小管上皮細胞及成纖維細胞，促進TGF-β1的合成和釋放，致使腎間質細胞外基質成分的過度產生［17-18］。血管緊張素轉化酶抑制劑（依那普利）能有效抑制AngⅡ的合成，減少體內AngⅡ的含量，從而減輕腎間質纖維化的程度［19］。血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（纈沙坦）有效地阻斷AngⅡ與其受體（AT1）相結合，亦可達到減輕腎間質纖維化的效果。近幾年的研究顯示，醛固酮不僅可以致水鈉潴留，而且可以促進組織膠原沉積和纖維化，是腎間質纖維化過程中的一個重要因素，在進展性腎臟損害中發揮重要的作用。有研究表明，醛固酮是有絲分裂和膠原合成的強烈刺激劑，可以促進腎臟纖維化［20］。本研究結果表明，與模型組比較，依那普利組、纈沙坦組、螺內酯組TGF-β1表達明顯下調，腎功能明顯好轉，腎損傷指數明顯降低，表明依那普利、纈沙坦、螺內酯對腎間質纖維化具有負性調節作用，通過下調TGF-β1的表達，減少細胞外基質的沉積，阻止腎間質纖維化的進展，延緩腎功能的惡化。

綜上所述，TGF-β1表達增多與腎間質纖維化密切相關。依那普利、纈沙坦、螺內酯均可通過下調TGF-β1表達而減輕腎間質纖維化程度，延緩腎功能惡化，但三組間比較差異無統計學意義（P＞0.05），說明其抗腎間質纖維化的作用效果相近。

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Effect of Different Aspects of the Intervention of the Renin Angiotensin Aldosterone System on Renal Tissue of Rats with Unilateral Ureteral Obstruction

HAN Xiao-qing，SUN J ian-ping，LI Na，et al.
Medical Innovation of China，2016，13（13）：001-005

【Abstract】Objective：Toobservetheeffectsofdifferentaspectsoftheinterventionofthereninangiotensin aldosteronesystemontherenaltissueofratswithunilateralureteralobstruction.Method：Atotalof50SDrats whichwas6weeksoldwereselectedastheresearchobjects，theywererandomlydividedintothenormalgroup，modelgroup，Enalaprilgroup，ValsartangroupandSpironolactonegroup，eachgrouphad10rats.Therat modelofunilateralureteralobstruction（UUO）wasused，thenormalgroupandmodelgroupweregivensaline10 mL/（kg·d）0.9%SodiumChlorideSolutionbefore24hformodelingto14daftermodeling；Enalaprilgroup，ValsartangroupandSpironolactonegroup24hformodelingto14daftermodelingwererespectivelytreated withEnalapril10mg/（kg·d），Valsartan10mg/（kg·d），Spironolactone100mg/（kg·d），ratsineach groupweresacrificedat2weeksaftermodeling，bloodandurinesampleswerecollectedforbiochemicaltests，theobstructiverenaltissuesTGF-β1mRNA，angiotensinogen（AGT）mRNA，vasculartensionangiotensin convertingenzyme（ACE）mRNAandaldosterone（ALD）mRNAexpressionwereobservedaccordingrenal tissueforHEstainingandreversetranscriptasepolymerasechainreaction（RT-PCR）method.Result：Compared withnormalgroup，theserumcreatinineandureanitrogenwereincreasedinthemodelgroup，enalaprilgroup，ValsartangroupandSpironolactonegroup，modelgroupincreasedmostsignificantly，thedifferenceswere statisticallysignificant（P＜0.05），therewerenostatisticallysignificantdifferencesintheEnalaprilgroup，ValsartangroupandSpironolactonegroup（P＞0.05）.Therewerenosignificantdifferencesinfivegroupsof24h urineprotein（P＞0.05）.TherenalinterstitialinjuryindexofEnalaprilgroup，valsartangroupandSpironolactone groupwerehigherthannormalgroup，butlowerthanmodelgroup，thedifferenceswerestatisticallysignificant（P＜0.05）.Conclusion：Blockadeoftherennin-angiotensin-aldosteronesystematdifferentlevelscouldinhibit renalinterstitialfibrosisinratsandtheeffectissimilar.

【Key words】Renalinterstitialfibrosis；Renin-angiotention-aldosteronesystem；Rat

*基金項目：國家自然科學基金面上項目（81170653）

通信作者：孫建平

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.13.001

收稿日期：（2016-01-14）（本文編輯：李穎）