靈芝多糖對荷膀胱癌T24細胞小鼠T細胞亞群及AQP1、AQP3表達的影響

王成財，梁文波

(1. 大連大學附屬新華醫院 腫瘤科，遼寧 大連 116000；2.錦州醫科大學附屬第一醫院 泌尿外科，遼寧 錦州 121000)

靈芝多糖對荷膀胱癌T24細胞小鼠T細胞亞群及AQP1、AQP3表達的影響

王成財1,2，梁文波1Δ

(1. 大連大學附屬新華醫院 腫瘤科，遼寧 大連 116000；2.錦州醫科大學附屬第一醫院 泌尿外科，遼寧 錦州 121000)

目的 研究靈芝多糖對荷膀胱癌T24細胞小鼠T細胞亞群及AQP1、AQP3表達的影響。方法 選擇BALB/c裸鼠30只作為實驗動物，皮下注射膀胱癌T24細胞建立荷膀胱癌動物模型，隨機分為對照組、順鉑組、靈芝多糖+順鉑組各10只，順鉑組給予順鉑25 mg/kg腹腔注射，順鉑+靈芝多糖組小鼠給予靈芝多糖200 mg/kg灌胃，順鉑25 mg/kg腹腔注射，對照組給予相當體積的生理鹽水灌胃。測定腫瘤組織的體積和質量、外周血中T細胞亞群的含量以及腫瘤組織中AQP1、AQP3、Caspase-3、Bax的mRNA含量。結果 順鉑組、順鉑+靈芝多糖組小鼠腫瘤組織的體積、腫瘤組織質量明顯低于對照組(P<0.05)，順鉑+靈芝多糖組小鼠腫瘤組織體積、腫瘤組織質量明顯低于順鉑組(P<0.05)；順鉑組、順鉑+靈芝多糖組CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD4+/CD8+均明顯高于對照組(P<0.05)，順鉑+靈芝多糖組CD4+T細胞、CD4+/CD8+均明顯高于順鉑組(P<0.05)；順鉑組、順鉑+靈芝多糖組小鼠腫瘤組織中Bax、Caspase-3的mRNA含量明顯低于對照組(P<0.05)，順鉑+靈芝多糖組鼠腫瘤組織中Bax、Caspase-3的mRNA含量明顯低于順鉑組(P<0.05)；順鉑組、順鉑+靈芝多糖組小鼠腫瘤組織中AQP1、AQP3的mRNA含量明顯低于對照組(P<0.05)；順鉑+靈芝多糖組小鼠腫瘤組織中AQP1、AQP3的mRNA含量明顯低于順鉑組(P<0.05)。結論 靈芝多糖干預能夠抑制荷膀胱癌T24細胞小鼠的腫瘤生長，增強細胞免疫功能，調節凋亡基因、AQP1、AQP3的表達水平。

膀胱癌；靈芝多糖；T細胞亞群；水通道蛋白；凋亡

膀胱癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤，其中超過70%為淺表性膀胱癌，多數能夠通過手術切除，但是術后的復發率較高。有研究表明，淺表性膀胱癌(superficial bladder cancer，SBC)往往術后容易復發，術后需要進行膀胱灌注化療[1]。因此，膀胱癌術后繼續進行藥物輔助治療以預防腫瘤的復發有助于改善患者的預后情況。膀胱癌的復發與免疫逃逸、細胞凋亡異常有關，選用具有免疫調節功能和促凋亡效應的藥物能夠預防腫瘤復發[2]。靈芝多糖是具有抗腫瘤效應的中藥材，能夠通過調節免疫功能、減少血管新生來抑制腫瘤的發展[3]。本研究分析了靈芝多糖對荷膀胱癌T24細胞小鼠T細胞亞群及AQP1、AQP3表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：BALB/c裸鼠30只，雌性，6～8周，體重15～25 g，購買于康生物科技股份有限公司(合格證號：SCXK(京)2014-0005)，購回后適應性飼養周，飼養條件：室溫18～27 ℃，相對濕度40～70%。本次研究報經醫院動物倫理委員會批準，同時嚴格遵守《實驗動物管理條例》。

1.1.2 藥物與試劑：人膀胱癌細胞株T24購買于中科院上海細胞庫；細胞培養用液體、消化酶購買于Hyclone公司；靈芝多糖購買于杭州眾芝康菇生物技術有限公司；CD3、CD4、CD8抗體購買于上海鑫樂生物科技有限公司(美國Biolegend原裝)；Trizol提取液、M-MLV反轉錄酶購買于Invitrogen公司，熒光定量PCR試劑購買于Promega公司。

1.1.3 主要實驗儀器：CO2細胞培養箱(美國ITienno公司)；PCR擴增儀(Eppendorf公司)；凝膠成像系統(法國VILBERLOURMAT公司)；電泳儀(北京六一儀器廠)；電子天平(德國Sartorius公司)；流式細胞儀(CyFlow Cube,CyFlow Ploidy Analyser)(德國PARTEC公司)。

1.2 方法

1.2.1 荷膀胱癌T24細胞小鼠模型的建立[3]：復蘇膀胱癌細胞株T24，培養后進行消化和傳代，取對數期生長的細胞并調節密度至1.0×107/L，將200 μL腫瘤細胞懸液接種在小鼠右側腋窩的皮下組織。待腫瘤組織生長至縱徑4～5 mm后表示荷瘤模型建立成功。采用隨機數字表法將30只小鼠分為空白對照組、順鉑組、順鉑+靈芝多糖組各10只。

1.2.2 藥物干預方法：順鉑組給予生理鹽水灌胃，1次/d，連續干預18 d，給予順鉑25 mg/kg腹腔注射，1次/d，連續干預5 d；順鉑+靈芝多糖組小鼠給予靈芝多糖200 mg/kg灌胃，1次/d，連續干預18 d，順鉑25 mg/kg腹腔注射，1次/d，連續干預5 d；對照組給予相當體積的生理鹽水灌胃，1次/d，連續干預18 d，生理鹽水腹腔注射，1次/d，連續干預5 d。

1.2.3 腫瘤體積和質量：于實驗第19天在SPF實驗室操作臺按動物福利學將小鼠脫頸斷頭處死， 處死小鼠后解剖得到腫瘤組織，用電子天平對腫瘤組織進行稱重，用游標卡尺測量腫瘤組織的體積。

1.2.4 外周血T淋巴細胞亞群含量：處死小鼠后取外周血組織，分別孵育CD3、CD4、CD8的熒光抗體，緩沖液洗滌后1 500 r/min離心5 min，PBS重懸并用流式細胞儀測定CD3+、CD4+、CD8+的比例，計算CD4+/CD8+的比例。

1.2.5 腫瘤組織中基因的表達量：取腫瘤組織置于勻漿器，用Trizol法提取總RNA，反轉錄為cDNA后采用Promega公司的qPCR Master MI型進行熒光定量PCR擴增,(AQP)AQP1上游引物序列：5’-GCTCACCCGCAACTTCTCA-3’，下游：5’-TCCTCTATTTGGGCTTCATCTC-3’(212bp)；AQP3上游引物序列 :5′-TGGTGGCTTCCTCACCATCAA-3′, 下游:5′-CGAGCCCAAAA-ACAATCCCAGC-3′(209 bp)；caspase-3 上游引物序列：5′-GACTAGCTTCTTCAGAGGCGA-3′;下游:5′-ATTCCGTTGCCAC-CTTCCTG-3′(322bp)；Bax上游引物序列 ：F 5’-GGCGAATT-GGAGATGAAC-3’，下游：5’-CCGAAGTAGGAGAGGAGG-3’(307 bp)，(94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火1s，72 ℃延伸1 min，共34循環；72 ℃延伸10 min，94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 min，共32循環；72 ℃繼續延伸10 min)，反應體系為cDNA 1 μL、Master mix 10 μL、上下游引物各0.4 μL、ddH2O8.2 μL。得到擴增曲線后，以GAPDH為內參計算目的基因水通道蛋白(AQP)AQP1、AQP3、Caspase-3、Bax的mRNA含量。

2 結果

2.1 腫瘤體積和質量 順鉑組、順鉑+靈芝多糖組小鼠腫瘤組織的體積、腫瘤組織質量明顯低于對照組(P<0.05)；順鉑+靈芝多糖組小鼠腫瘤組織體積、腫瘤組織質量明顯低于順鉑組(P<0.05)。見表1。

表1 3組小鼠的腫瘤體積和質量比較Tab.1 Comparison of tumor volume and mass between three groups(±s)

*P<0.05，與對照組比較comparedwithcontrolgroup；#P<0.05，與順鉑組比較comparedwithcisplatingroup

2.2 外周血T細胞亞群含量 順鉑組、順鉑+靈芝多糖組CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD4+/CD8+均明顯高于對照組(P<0.05)；順鉑+靈芝多糖組CD4+T細胞、CD4+/CD8+均明顯高于順鉑組(P<0.05)。見表2及圖1。

表2 3組小鼠外周血T細胞亞群的含量比較Tab 2 Comparison of T lymphocyte subsets in peripheral blood between three groups(±s)

*P<0.05，與對照組比較comparedwithcontrolgroup;#P<0.05，與順鉑組比較comparedwithcisplatingroup

圖1 3組小鼠外周血T細胞亞群的含量比較(n=10)Fig.1 Comparison of T lymphocyte subsets in peripheral blood between three groups(n=10)

2.3 腫瘤組織中Bax、Caspase-3的mRNA順鉑組、順鉑+靈芝多糖組小鼠腫瘤組織中Bax、Caspase-3的mRNA含量明顯低于對照組(P<0.05)；順鉑+靈芝多糖組鼠腫瘤組織中Bax、Caspase-3的mRNA含量明顯低于順鉑組(P<0.05)。見表3及圖2。

表3 3組小鼠腫瘤組織中Bax、Caspase-3的mRNA含量比較Tab.3 Comparison of mRNA of Caspase-3 and bax in tumor tissues between three groups(±s)

*P<0.05，與對照組比較comparedwithcontrolgroup；#P<0.05，與順鉑組比較comparedwithcisplatingroup

圖2 3組小鼠腫瘤組織中Bax、Caspase-3的mRNA含量比較，M：Marker；C：對照組；S：順鉑組；L：順鉑+靈芝多糖組。Fig.2 Comparison of mRNA in Caspase-3 and Bax of tumor tissues betweem three groupsM:Marker, C:Control group;S:Cisplatin group; L:Cisplatin combined ganoderma lucidum polysaccharide group

2.4 腫瘤組織中AQP1、AQP3的mRNA含量 順鉑組、順鉑+靈芝多糖組小鼠腫瘤組織中AQP1、AQP3的mRNA含量明顯低于對照組(P<0.05)；順鉑+靈芝多糖組小鼠腫瘤組織中AQP1、AQP3的mRNA含量明顯低于順鉑組(P<0.05)。見表4及圖3。

表4 3組小鼠腫瘤組織中AQP1、AQP3的mRNA含量Tab.4 Comparison of mRNA in AQP1 and AQP3 of tumor tissues betweem three groups(±s)

*P<0.05，與對照組比較comparedwithcontrolgroup；#P<0.05，與順鉑組比較comparedwithcisplatingroup

圖3 3組小鼠腫瘤組織中AQP1、AQP3的mRNA含量比較，M：Marker；C：對照組；S：順鉑組；L：順鉑+靈芝多糖組。Fig.3 Comparison of mRNA in AQP1 and AQP3 of tumor tissues between 3 groups M:Marker, C: Control group; S: Cisplatin group; L: Cisplatin combined ganoderma lucidum polysaccharide group

3 討論

膀胱癌是泌尿生殖系統常見的惡性腫瘤之一，目前主要的治療方法是手術切除，輔助以術后放療和化療。但是，放療和化療的不良反應多、患者耐受性較差，且在長期放療和化療過程中，會出現藥物和放射線耐受的情況，影響整體治療效果。如何通過有效的藥物輔助治療來預防膀胱癌復發是臨床的重要課題。

靈芝多糖為靈芝屬真菌絲體次生代謝產物，由三股單糖鏈構成的大分子化合物，是從靈芝孢子粉中提取的水溶性多糖成分。靈芝多糖是靈芝的主要活性成分，具有廣泛的藥理活性，其抗腫瘤作用備受關注[4]。最早關于靈芝多糖的研究證實，該藥物對S180肉瘤的生長具有抑制作用。近年來的研究發現，靈芝多糖能夠通過抑制血管新生、調節免疫功能的途徑來發揮抗腫瘤效應[5-6]。本實驗研究結果表明，與對照組、順鉑組比較，順鉑+靈芝多糖組小鼠腫瘤組織的體積顯著縮小、腫瘤組織的質量顯著減輕。提示靈芝多糖能夠抑制荷膀胱癌T24細胞小鼠的腫瘤生長。已有研究報道，靈芝多糖具有明確的免疫調節作用[7-10]。CD4+細胞可協助B細胞分泌抗體和調節其他T細胞的免疫應答，CD8+細胞常表現細胞毒活性，是主要的細胞毒效應細胞[11]。本實驗研究中，本文研究中，順鉑+靈芝多糖組CD4+T細胞、CD4+/CD8+均明顯高于順鉑組，提示靈芝多糖能夠增強荷膀胱癌T24細胞小鼠的細胞免疫功能和體液免疫功能。

目前關于靈芝多糖與膀胱癌細胞凋亡的關系尚缺乏研究。Bax和Caspase-3是已知的促凋亡基因，Bax能夠促進線粒體內的細胞色素C釋放進入胞漿，進而激活Caspase所介導的級聯放大反應并引起細胞凋亡[12-13]。我們對膀胱癌組織中促凋亡基因表達量的分析證實，與順鉑組比較，順鉑+靈芝多糖組小鼠腫瘤組織中Bax、Caspase-3的mRNA含量明顯降低。說明靈芝多糖干預能夠下調荷膀胱癌T24細胞小鼠腫瘤組織中凋亡基因的表達。水通道蛋白(AQP)是近年來新發現的增殖相關分子，包括AQP0-AQP12共13名成員，參與不同組織和器官水通透性的調節。已有研究報道，AQP1、AQP3高表達與膀胱癌的發生、復發密切相關[14]。AQP1主要參與腫瘤血管通透性的調節，能夠促進腫瘤血管新生以及細胞增殖，同時也有利于腫瘤的遷移和侵襲[15]；AQP3的主要生物學效應是促進細胞的遷移，既有利于腫瘤細胞穿過微血管屏障并向遠處遷移，也能夠促進內皮細胞遷移、增加新生血管形成[16]。本實驗研究中，順鉑+靈芝多糖組小鼠腫瘤組織中AQP1、AQP3的mRNA含量明顯低于對照組與順鉑組，Huang等[17]也有類似的文獻報道，提示靈芝多糖有助于下調小鼠腫瘤組織中AQP1、AQP3表達水平。

本文研究表明，靈芝多糖干預能夠抑制荷膀胱癌T24細胞小鼠的腫瘤生長、增強細胞免疫功能，調節促凋亡基因、AQP1、AQP3的表達，可作為膀胱瘤化療輔助用藥，其可能作用機制還有待于更多的基礎研究與臨床研究去證實。

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(編校：師維康)

Effect ofganodermalucidumpolysaccharides on T cell subsets and AQP1, AQP3 expression of bladder cancer T24 cell line bearing mice

WANG Cheng-cai1,2, LIANG Wen-bo1Δ

(1. Department of Oncology, Xinhua Hospital Affiliated to Dalian University, Dalian 116000, China; 2. Department of Urinary Surgery, the First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, China)

ObjectiveTo study the effect ofganodermalucidumpolysaccharides on T cell subsets and AQP1, AQP3 expression of bladder cancer T24 cell line bearing mice.Methods60 BALB/C nude mice were selection as experimental animals, bladder tumor bearing animal models were made by bladder cancer T24 cells subcutaneous injection, and were randomly divided into control group, cisplatin group,ganodermalucidumpolysaccharides and cisplatin group, cisplatin group given 25 mg/kgcisplatin intraperitoneal injection, cisplatin combinedganodermalucidumpolysaccharide group given 200 mg/kgganodermalucidumpolysaccharide lavage, 25 mg/kg cisplatin intraperitoneal injection, the control group given quite a volume normal saline lavage. Then tumor volume and weight, peripheral blood T cell subsets and AQP1, AQP3, Caspase-3, Bax mRNA content in tumor tissue were determined.ResultsCisplatin group, cisplatin combinedganodermalucidumpolysaccharide tumor volume and mass were significantly lower than the control group (P<0.05), cisplatin andganodermalucidumpolysaccharide tumor volume and mass were significantly lower than that cisplatin group (P<0.05); Cisplatin group, cisplatin combinedganodermalucidumpolysaccharides group CD4+T cells, CD8+ T cells , CD4+/ CD8+were significantly higher than that of control group (P<0.05), cisplatin combinedganodermalucidumpolysaccharide group CD4+T cells, CD4+/ CD8+were significantly higher than that of cisplatin group(P<0.05); Cisplatin group, cisplatin combinedganodermalucidumpolysaccharide group mices tumor tissues Bax, Caspase 3 mRNA content were significantly lower than the control group (P<0.05), cisplatin combinedganodermalucidumpolysaccharide group Bax,caspase 3 mRNA content were significantly lower than that of cisplatin group (P<0.05); Cisplatin group, cisplatin combinedganodermalucidumpolysaccharide group mice tumor tissue AQP1, AQP3 mRNA content were significantly lower than the control group (P<0.05); Cisplatin combinedganodermalucidumpolysaccharide group AQP1, AQP3 mRNA content were significantly lower than cisplatin group (P<0.05).Conclusionganodermalucidumpolysaccharide can inhibit tumor growth and enhance cellular immune function of bladder cancer T24 cell line bearing mice, and adjust the expression of pro-apoptotic genes, AQP1 and AQP3.

Bladder cancer;ganodermalucidumpolysaccharide; T cell subsets; water channel protein; apoptosis

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.12.008

遼寧省自然科學基金資助項目(201202131)

王成財，男，本科，主治醫師，研究方向：泌尿系腫瘤,E-mail：wangchengc2004@163.com；梁文波，通信作者，男，博士，主任醫師，研究方向：腫瘤免疫治療，E-mail：dllwb@126.com。

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