銅綠假單胞菌產生耐藥性的機制

孟鑫，尚德靜

(遼寧師范大學 生命科學學院，遼寧 大連 116081)

銅綠假單胞菌產生耐藥性的機制

孟鑫，尚德靜Δ

(遼寧師范大學 生命科學學院，遼寧 大連 116081)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，P.aeruginosa)與其它革蘭氏陰性菌相比，其外膜滲透性低，并且多種耐藥機制協同作用，更容易表現出對大多數抗生素極低的易感性，從而加入了“超級細菌”的行列。最近使用突變體庫篩選，微陣列技術和突變頻率分析已經證實在體內生長條件或復雜的適應條件下(如biofilm生長或群體遷移)，抗生素本身也能夠誘發非常大的基因團簇突變從而導致耐藥性以及新的適應性抗性。

銅綠假單胞菌 耐藥性 適應性抗性

自臨床引入抗生素并濫用抗生素以來，細菌具有越來越復雜的耐藥性，導致“超級細菌”的出現和擴散，幾乎對市場上所有可用的抗菌藥物都有一定的抗性。銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，P.aeruginosa)是革蘭氏陰性細菌，可以廣泛感染動植物宿主[1]，常見的醫院感染中有10～15%是由其引起的[2]，主要引起了囊性纖維化(cystic fibrosis，CF)患者的慢性肺部感染[3-4]。此外，P.aeruginosa是呼吸機相關性肺炎(ventilator associated pneumonia，VAP)最常見的致病菌之一[5-6]，P.aeruginosa引起的肺炎，常常導致急性肺損傷和繼發性膿毒癥，造成高死亡率[7-11]。

與其他病原體相比，P.aeruginosa對多種抗生素(包括氨基糖苷類，氟喹諾酮類和β-內酰胺類)顯示出較強的內源性抗性。例如：對羧芐青霉素的內源性抗性使得大多數β-內酰胺類(包括美羅培南而非亞胺培南)抗生素的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)增加4～8倍；對非β-內酰胺抗生素如喹諾酮，甲氧芐氨嘧啶，四環素和氯霉素也有一定的內源性抗性。這種內源性抗性主要源于其極低的外膜滲透性或外排系統被激活產生的去抑制作用。P.aeruginosa外膜中存在大量無效的成孔蛋白，限制了抗生素分子穿入細胞的速度[12]，使得次級適應性抗性機制能更有效地運行，如增加外排功能和酶對抗生素的修飾。

這些內在機制是P.aeruginosa遺傳組成的一部分，可以通過突變來穩定或增強，有些突變影響耐藥性基因的表達及產物的活性從而導致MIC變大，使許多常見的抗生素對P.aeruginosa沒有效果，其他突變可能輕微地增加耐藥性，使P.aeruginosa在大多數抗生素作用下的易感性逐漸降低，此外，一些菌株還可以通過水平轉移(即菌株之間)抗性基因決定簇增加耐藥性。

除了內源性抗性這種比較傳統的耐藥機制，近年來發現P.aeruginosa對不斷變化的環境條件和脅迫有很強的適應性，也可以引起對抗生素的適應性抗性，如接觸抗生素，改變培養基條件或改變生長狀態等[13]，這種適應性抗性的現象早就報道過，然而，最近才研究其對臨床問題的廣泛適用性。

雖然抗生素對多數由P.aeruginosa引起的感染有效，但是其仍可以通過多種方式產生耐藥性，導致耐藥率不斷增加，加之其內源的高耐藥性，使得開發新的藥物非常具有挑戰性。為此，了解P.aeruginosa產生耐藥性的機制是非常重要的，本文描述了有關P.aeruginosa耐藥機制的最新發現，并分析抗生素在臨床治療的相關現象。

1 內源性耐藥

P.aeruginosa對大多數的抗生素，如青霉素G、氨基青霉素，第一代和第二代頭孢菌素等β-內酰胺類藥物具有天然耐藥性，與其他革蘭氏陰性細菌相比，野生型的P.aeruginosa的外膜滲透性低(比大腸桿菌的滲透性低12～100倍)，使其對抗生素具有極低的易感性。革蘭氏陰性細菌的外膜是抵制抗生素入侵的選擇性屏障[12]，常常被比作分子篩，大多數親水性分子通過細菌細胞外膜上通道蛋白的水分子擴散進入細菌，所以擴散效率與抗生素分子的體積大小有關。P.aeruginosa細胞外膜中成孔蛋白F(Outer membrane channel proteins F，OprF)數量較少，所形成的大的通道數量少，因此其對抗生素分子的進入具有很大的限制，而其它形成小體積通道的成孔蛋白如外膜通道蛋白D(Outer membrane channel proteins D，OprD)和外膜通道蛋白B(Outer membrane channel proteins B，OprB)僅允許小體積的抗生素分子通過，還有些特異性成孔蛋白如OprD，允許碳青霉烯類抗生素攝入；某些陽離子抗菌肽可以通過自我促進方式橫過疏水的雙分子外膜。雖然低外膜滲透性影響了藥物大幅度攝取，但親水分子可以在幾秒鐘內橫跨外膜，達到內外平衡，說明P.aeruginosa除了具有高內源耐藥性，可能還有其它耐藥機制，如適應性機制：外排泵被誘導表達，引起藥物加速外排；抗性結瘤細胞分裂(resistant nodule cell division，RND)系統MexAB-OprM和MexXY-OprM的表達，以及AmpC(一種由P.aeruginosa的染色體或質粒介導產生的一類β-內酰胺酶，屬β-內酰胺酶Ambler分子結構分類法中的C類)β-內酰胺酶的產生也有助于降低抗生素跨外膜流動[14]。

此外，生物膜(biological film，biofilm)本身就具有抵制抗生素的能力。最近的研究提出了biofilm的抗性作用的幾種方式：第一，biofilm基質可以充當擴散性滲透的屏障，阻止抗生素到達其靶位；第二，biofilm內的微環境使細菌生長緩慢，例如還原氧區；第三，biofilm內的細菌亞群似乎分化為持久性細菌，大大降低了對抗生素的易感性；最后，biofilm內存在幾種特異性調節的抗性基因。

最近，通過對導致抗生素敏感性增加的突變體的突變體庫篩選研究[15-19]，提出了P.aeruginosa對抗生素內源性抗藥的幾種新機制。即來自不同功能類的幾十個基因可參與突變，并且這種突變形成了基因團簇的一部分。例如，突變株在許多基因中可以影響DNA的復制、重組及修復，從而顯示對環丙沙星敏感性增加。有趣的是，細胞分裂基因ftsK中的突變對環丙沙星和β-內酰胺也有抗性作用[16-18]。同樣地，參與藻酸鹽合成的基因突變對β-內酰胺亞胺培南的易感性增加[20]。

目前，在用亞抑制或致死濃度抗生素治療的微陣列實驗中觀察到失調基因和耐藥性基因之間的重疊，這表明P.aeruginosa適應性地激活防御機制以抵御抗生素的抑制作用。這些研究共同證明了P.aeruginosa的高耐藥性是幾種同時作用的機制最終作用的結果，其潛在的機制可能會在臨床結果中發揮重要作用。

2 獲得性耐藥

2.1 不同菌株間的水平轉移(horizontal transfer) 除內源的高耐藥性之外，P.aeruginosa還可通過部分可遺傳性狀增加耐藥性[21]。獲得性耐藥的兩種類型包括遺傳元件的水平轉移和突變性。DNA元件(包括質粒，轉座子，整合子，原噬菌體等)可以攜帶并且能夠通過接合、轉化或轉導的方式獲得抗生素抗性基因，從而增加抗生素抗性，甚至由于質粒包含多個抗性盒而具有多藥耐藥性[22]。這種水平轉移主要增強了P.aeruginosa對氨基糖苷類和β-內酰胺類的抗性，對其它幾類抗生素也有一定影響，例如：可移動遺傳元件上的氨基糖苷修飾酶滅活氨基糖苷類，導致氨基糖苷類的各種化學修飾，同時引起30S核糖體亞基(氨基糖苷類的主要靶標)親和力降低[22]。一些P.aeruginosa菌株除了有AmpC β-內酰胺酶外，還獲得了編碼新的β-內酰胺酶的質粒[23，從而對青霉素和頭孢菌素產生耐藥性，因此，P.aeruginosa對β-內酰胺抗生素獲得性耐藥的主要機制是β-內酰胺酶的產物對β-內酰胺類抗生素有抗性。目前，令人關注的是質粒介導的廣譜β-內酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLS)的增殖和金屬-β-內酰胺酶(metal-beta-lactamase，MBL)對碳青霉烯類的滅活。

2.2 突變性 獲得性耐藥的第二種形式是突變。細菌在脅迫條件下存活的關鍵機制之一是自發突變[16]，對付某個單一抗生素的自發突變頻率是10-6至10-9。但在DNA損傷劑的存在下或在biofilm的生長期間，突變率可以進一步增加[25-30]，例如：當細菌與亞抑制濃度的環丙沙星預孵育時，美羅培南的突變頻率增加了十倍；在biofilm生長期間，抗氧化酶下調導致DNA損傷增加，被biofilm包被的細菌對環丙沙星抗性的突變頻率與浮游細胞相比增加了100倍以上，另外biofilm包被的細菌在休眠細胞持續發育等因素影響下對抗生素抗性增加1000倍；此外，抗生素抗性分離株的出現主要與DNA錯配修復系統中的突變相關，由于錯配修復基因mutS，mutL和DNA氧化修復系統基因mutT和mutY中的突變引發了超強突變體，通常在CF患者中發現，它們通過增加β-內酰胺酶和MexCD-OprJ外排泵的表達量增強抗生素抗性[31-33]。相關的研究還揭示了P.aeruginosa外膜蛋白OprD中含有亞胺培南結合點的環2和環3中的任何突變都能引起構象變化導致碳青霉烯抗性。

P.aeruginosa一旦發生“突破”突變，能導致外排泵過度表達，抗生素攝取減少，β-內酰胺酶超量合成以及抗生素靶點改變，使抗生素失效[34]。P.aeruginosa臨床分離株中編碼MexR阻遏蛋白的染色體基因發生突變(即mexR突變)，促進mexA-mexB-oprM操縱子轉錄，使MexA-MexB-OprM過量表達從而對美羅培南易感性降低[35]。另外，由于mexZ突變，MexXY-OprM過表達導致P.aeruginosa臨床菌株對氨基糖苷，氟喹諾酮和頭孢吡肟產生抗性；特異性孔蛋白OprD中的突變降低了抗生素亞胺培南的攝取，因此導致臨床抗性；而mexT或mexS(nfxC)中的突變降低OprD表達以及促進外排泵MexEF-OprN表達導致亞胺培南和多種抗生素抗性；P.aeruginosa中ampD突變性失活引起AmpC β-內酰胺酶部分去阻遏表達，使P.aeruginosa對第三代頭孢菌素有獲得性抗性；目標酶的突變也可導致臨床意義上的抗性[36]，例如gyrA和gyrB(回旋酶)以及parC和parE(拓撲異構酶IV)的突變降低對氟喹諾酮結合親和力，進而導致臨床抗性。

最近使用Harvard文庫[37]篩選P.aeruginosaPA14研究表明在大多數條件下許多額外的突變可以導致耐藥性適度地增加(2倍)，并且這種增加在臨床中很容易被遺漏。文獻中已經提出低水平的抗性可以逐步演變為高水平的抗性[38]，在galU(中央中間代謝)，nuoG(能量代謝)，mexZ(轉錄調節子)或rplY(適應)中的單個突變只表現出對妥布霉素抗性增加兩倍，但是四重突變體對其抗性增加16倍[39]，因此，引起MIC中度變化的幾種突變的積累可隨時間推移導致抗性逐步增加，最終導致高水平抗性。

3 適應性耐藥

基因組時代的到來為更廣泛地理解適應性耐藥的復雜現象提供了條件。目前了解到許多誘發因素能夠誘導細菌的適應性耐藥，如抗生素，殺蟲劑，多胺，pH，厭氧生物，陽離子和碳源，細菌biofilm形成和群體遷移等[13]，這些誘發因素通過調節許多基因的表達從而對外排泵、細胞膜和酶產生影響。

環境因素和亞抑制濃度的抗生素使得P.aeruginosa基因表達模式發生變化，這種變化讓細菌可以抵制隨后暴露在致死濃度下的抗生素環境。適應性耐藥是可逆的，一旦去除誘導因子或條件，細菌就恢復到野生型的易感性，這也解釋了為什么在治療P.aeruginosa引起的感染病，體外效果好的抗生素在體內實驗沒效果的原因[40]。此外，亞抑制濃度的氨基-輔酶通過氨基糖苷反應調節劑(amino sugar response regulator，ARR)調節細胞內水平的次級中間體分子-環二GMP (cyclic-di-GMP )增強biofilm形成，亞MIC水平的抗生素通過抗生素靶基因中突變的積累促進P.aeruginosa對CF患者肺環境的適應，最終以biofilm的形式在惡劣環境中生存[41]。

聚陽離子抗生素如氨基糖苷類，多粘菌素和陽離子抗菌肽可以與P.aeruginosa外膜上的主要成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)相互作用，通過競爭性取代LPS上的二價陽離子而結合到LPS上，引起局部破壞，然后利用這些分子的兩親性特點通過自我促進方式穿過細菌外膜細胞膜[42]。arnBCADTEF操縱子通過向LPS的脂質A中添加4-氨基-阿拉伯糖，可以阻斷這種自我促進的攝取，進而導致耐藥性。對多粘菌素和陽離子抗菌肽的適應性耐藥可以由低濃度的二價陽離子(Mg2+和Ca2+)誘導使兩個雙組分調節系統PhoPQ和PmrAB活化，隨后誘導arn操縱子。最近發現一個新的雙組分調節系統ParRS，證明在治療假單胞菌藥物多粘菌素和某些抗菌肽存在的情況下介導了arn操縱子的上調，引起適應性耐藥[43]。

另一種適應性耐藥機制是亞抑制濃度抗生素暴露而導致編碼外排泵基因的過表達。一般來說，與腸桿菌科細菌相比，P.aeruginosa臨床分離株對大多數抗生素更不敏感。研究發現某些細菌蛋白質(OprM、OprJ、OprN)具有底物特異性，充當了活性外排系統的組分，因此，P.aeruginosa內源性耐藥水平在很大程度上由低膜滲透性和抗生素外排之間的相互作用決定[23]。例如，氨基糖苷類誘導MexXY外排泵過表達，引起某些調節變化，使抗生素更快速地被泵出，并且細菌變得適應性更強。Kohler等人[45]還報道了由于P.aeruginosa突變體nfxC過表達，外排操縱子mexE-mexF-oprN對喹諾酮，氯霉素和曲美他汀產生抗性，同時nfxC突變體還降低了OprD外膜蛋白的表達，因此其還顯示對碳青霉烯的交叉抗性。此外，肝泵常常介導多藥耐藥性。

在biofilm中生長的細菌也觀察到外排泵上調和其他耐藥機制，biofilm是在上皮和醫療裝置的表面上形成微生物聚集體的一種形式。和浮游細胞相比，在群體環境中生長的細菌細胞表現出不同的轉錄組，并且對許多不同的抗生素有耐藥性[46-48]。耐藥性表現在幾個方面[49]：首先，基因組基因團簇的研究證實許多基因的普遍失調(通過幾種機制，包括群體感應)能引起外排泵、酶、各種調節器及產物的表達上調，從而引發耐藥性。其次，biofilm內細菌在不同區域獲得的營養成分不同，導致其代謝活性有差異，其中生長在外層中的細胞代謝活躍，生長在內部的細胞生長更慢，一些抗生素僅作用于生長旺盛的細胞(例如大多數β-內酰胺和氨基糖苷類)，而多粘菌素優先殺死活力差的細菌，所以對生長在生物膜的不同區域的細菌都有影響。還有研究認為[50]，P.aeruginosa的部分耐藥性歸因于biofilm中的細胞的缺氧生長模式，發生在厭氧固定相或非生長狀態的細胞，易對抗生素產生抗性，而在biofilm內生長旺盛的細胞因為生長環境中有氧并且處于生長狀態，多對抗生素易感。雖然細胞外基質已被建議作為抗生素滲透的屏障，但它也可能有濃縮細胞外酶的作用，例如，在細菌表面附近分泌β-內酰胺酶。眾所周知，和浮游細胞相比，biofilm更具有持久性，可以容易地經受住應激條件(例如抗生素壓力)而緩慢生長或不增殖。關于P.aeruginosa中持久性細胞發育的機制鮮為人知; 然而，已知spoT，relA，dksA，rpoS，dinG，spuC，algR和pilH突變可以影響持久性，這些基因可能是藥物克服P.aeruginosa持久性問題和減少耐藥性發展的良好靶標。

適應性抗性也可能具有長期后果。如果細胞沒有完全根除，一旦停止治療就可以觀察到細菌再生長[51]。

4 討論與展望

P.aeruginosa可以在某些不復雜的感染中以相當有效的方式被根除。但在慢性CF患者感染中，P.aeruginosa形成biofilm和群體遷移的生活方式，對廣譜抗生素具有高度耐藥性，即使當對患者施用組合療法時，也非常難以治療，并且P.aeruginosa對目前可獲得的抗生素的耐藥性每年都在增加。由于這些原因，迫切需要發現更有效的藥物和新的治療策略以對抗由該超級細菌引起的感染。因為抗生素的不當使用有助于適應性增強，從而耐藥性逐步甚至突破性上升。一旦出現突破性耐藥性，能被有效治療的機會大大降低，所以在臨床環境中施用的最佳抗生素劑量需要確定。目前出現的多藥耐藥P.aeruginosa菌株，還沒有有效的抗生素用于治療，并且這些多藥耐藥性菌株可能會變得更常見。

進一步的研究希望開發全新的、更有效的抗菌劑或出臺新的策略，可以最大限度地減少耐藥問題。此外，抗生素在體外和體內效率可能存在差異，需要進行更多的體內研究，以重新評估某些抗生素的體內效率，這將有助于改善抗生素在人體感染中的使用。

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(編校：師維康)

Mechanism of drug resistance ofPseudomonasaeruginosa

MENG Xin, SHANG De-jingΔ

(Faculty of Life Science, Liaoning Normal University, Dalian 116081, China)

Pseudomonasaeruginosaexhibits an inherently reduced susceptibility to most antibiotics compared with most other Gram-negative bacterial species because its low outer membrane permeability and the multiple ways in whichP.aeruginosacan become drug-resistant.Pseudomonasaeruginosahas joined the “super bacteria”. Recent researches, using mutant library screening, microarray technology, and mutation frequency analysis have demonstrated that antibiotics themselves can induce very large groups of genes in vivo growth conditions or complex adaptation conditions (for example, biofilm growth or swarming motility), resulting in resistance as well as new forms of adaptive resistance.

Pseudomonasaeruginosa; resistance; adaptive resistance

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.12.058

孟鑫，女，碩士在讀，研究方向：分子遺傳學，E-mail:1317302082@qq.com；尚德靜，通信作者，女，博士，教授，博士生導師，研究方向：生物化學與分子生物學，E-mail:djshang@lnnu.edu.cn。

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