孫雨薇閆冬梅
(1.中國人民解放軍第209醫院 黑龍江牡丹江 157011;2.佳木斯大學基礎醫學院免疫教研室 黑龍江佳木斯 154007)
五味子多糖對SMMC-7721肝癌細胞凋亡的影響
孫雨薇1閆冬梅2*
(1.中國人民解放軍第209醫院 黑龍江牡丹江 157011;2.佳木斯大學基礎醫學院免疫教研室 黑龍江佳木斯 154007)
[目的]研究五味子多糖(SCP)對肝癌細胞SMMC-7721凋亡的影響。[方法] 不同濃度SCP作用于SMMC-7721,cck-8法檢測藥物對細胞增殖的影響;Tunnel檢測細胞凋亡變化。[結果]SCP能夠抑制肝癌細胞的增殖。熒光顯微鏡下可見細胞呈現典型的凋亡細胞形態。[結論]SCP能抑制肝癌細胞的增殖,誘導凋亡。但詳細機制尚需進一步研究。
五味子多糖 SMMC-7721細胞 細胞凋亡
五味子多糖(SCP)是中藥五味子的主要有效成分之一,具有較好的抑瘤作用[1]。本研究探討SCP對SMMC-7721細胞增殖及凋亡的影響,從而為肝癌的治療提供實驗依據。
1.1 細胞株
人肝癌SMMC-7721細胞株,本研究室保存。
1.2 藥品
SCP購自寧夏宏德生物制品有限公司,用RPMI 1640培養液溶解成 200 mg/mL的儲備液,過濾除菌, 4 ℃保存,實驗時加培養液稀釋至所需濃度。
1.3 試劑
RPMI 1640購自美國Hyclone 公司,新生牛血清購自杭州四季青公司,胰蛋白酶、CCK-8、Tunnel試劑盒、Hoechst33342購于碧云天生物技術研究所。
1.4 主要儀器
MCO-15AC恒溫CO2培養箱(日本SANYO公司);Nikon ECLIPSE 80i熒光顯微鏡、DXM 1200 C數碼相機(尼康公司);Multiskan Mk3酶標儀(Thermo公司)。
2.1 細胞培養
SMMC-7721細胞培養于含10%滅活新生牛血清RPMI 1640培養基,37 ℃、5% CO2飽和濕度下常規培養,0.25%胰蛋白酶消化傳代,每2-3 d傳代1 次。
2.2 CCK-8法檢測細胞增殖
SMMC-7721細胞經胰酶消化,以5×105個/mL接種于96孔板,每孔200 μL,37℃、5%CO2培養。當細胞融合達80%時,分別加入SCP(終質量濃度為0,0.625,1.25,2.5,5,10,20 mg/mL),每個濃度3復孔,分別培養24,48,72 h加入CCK-8試劑,每孔20 μL,繼續培養3 h,450 nm波長檢測各孔A (吸光度)值,實驗重復3次。計算細胞生長抑制率(IR):IR(%)=(1- 實驗組A均值/對照組A均值)×100%。計算各組藥物的半數抑制率 IC50。
圖1 給藥48 h后SMMC-7721細胞凋亡結果(Tunnel染色)
2.3 Tunel染色法檢測細胞凋亡
SMMC-7721細胞接種于6孔板中,每孔加3 mL培養液,于37℃、5%CO2培養。分為SCP組(10 mg/mL)和對照組(SMMC-7721),每組3復孔。培養48 h,PBS洗滌細胞,4%多聚甲醛固定30 min; PBS洗滌,加入0.1% TritonX-100 PBS冰浴2 min。PBS洗滌細胞后移入濕盒中,加入100 μL的Tunnel檢測液(現配現用),37℃避光60 min。PBS洗滌細胞,37℃下Hoechst33342染色40 min;PBS洗滌,熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況,拍照。
2.4 統計學分析
3.1 SCP對SMMC-7721細胞的增殖抑制作用
各劑量組SCP對SMMC-7721細胞生長均有抑制作用,呈現一定程度的劑量依賴性,差異有統計學意義( P<0.001或 P<0.01)。5 mg/mL以上抑制率隨時間延長而逐漸提高,呈時間依賴性。10 mg/mL SCP在48、72 h抑制率分別為51.59%、60.14%,20 mg/ mL SCP在24、48、72 h的抑制率分別達到67.08%、79.99%、92.44%,說明SCP體外對SMMC-7721細胞確實具有抑制作用。經計算,24, 48,72 h的 IC50分別為16.48,11.12,9.09 mg/mL,故后續實驗使用濃度為10 mg/mL的劑量,藥物作用時間為48 h。
3.2 SCP對凋亡細胞形態學的影響
熒光顯微鏡下可見,對照組細胞核染色正常,極少有標記凋亡細胞的綠色熒光;給藥組細胞核基本沒有破裂,但能觀察到較多標記凋亡細胞的綠色熒光(圖1)。
研究發現,SCP對S180荷瘤小鼠有抑瘤作用,使凋亡增加,瘤內炎細胞增多,瘤周炎細胞浸潤增加,瘤細胞異型性降低,核分裂像減少,瘤細胞退變明顯[2]。于赫[3]等發現SCP對H22肝癌荷瘤小鼠移植瘤具有重要作用。因此,SCP具有預防和治療腫瘤的潛在價值。
本研觀察了不同濃度五味子多糖對SMMC-7721細胞的影響,結果發現,五味子多糖可抑制細胞增殖和誘導凋亡。說明五味子多糖可以在體外通過誘導SMMC-7721細胞凋亡,抑制肝癌細胞增殖發揮抗腫瘤作用,可能在治療肝癌上發揮一定的作用。但其抗腫瘤的具體機制還不清楚,仍待進一步研究。
[1]張蘭杰,張維華,趙珊紅.北五味子果實中多糖的提取與純化研究[J].鞍山師范學院學報,2002,4(1):58-60.
[2]黃玲,陳玲,張振林.五味子多糖對荷瘤鼠瘤體抑制作用的病理學觀察[J].中藥材,2004,24(3):202-203.
[3]于赫,李冀,齊彥.五味子多糖對肝癌小鼠腫瘤生長的抑制作用及其免疫學機理初探[J].中醫藥信息,2010,27(2):26-24.
R285.5
A
1674-2060(2016)03-0200-01
孫雨薇(1983—),女,主管藥師,主要從事藥品配制與檢驗及免疫學的研究。
閆冬梅,碩士,副教授,主要從事疫苗的免疫學評價和中草藥免疫的研究。