艾滋病合并慢性乙型肝炎感染患者對拉米夫定耐藥的研究

黃思敏 蔡衛平 胡鳳玉 廖寶林 蘭蕓 陳友鵬 唐小平

510630 暨南大學附屬第一醫院(黃思敏、陳友鵬)；510060 廣州市第八人民醫院(蔡衛平、胡鳳玉、廖寶林、蘭蕓、唐小平)

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·病毒病診斷與治療·

艾滋病合并慢性乙型肝炎感染患者對拉米夫定耐藥的研究

黃思敏 蔡衛平 胡鳳玉 廖寶林 蘭蕓 陳友鵬 唐小平

510630 暨南大學附屬第一醫院(黃思敏、陳友鵬)；510060 廣州市第八人民醫院(蔡衛平、胡鳳玉、廖寶林、蘭蕓、唐小平)

目的 了解拉米夫定(3TC)治療艾滋病(AIDS)/慢性乙型肝炎(CHB)合并感染患者對3TC的耐藥情況。方法 收集廣州市第八人民醫院2005年至2010年接受含3TC方案治療的AIDS/CHB合并感染患者的資料，檢測患者抗病毒治療前和治療12個月、24個月、36個月、48個月和60個月時HBV DNA含量，對HBV DNA陽性患者，擴增HBV 逆轉錄酶區，分析HBV變異情況。 結果 185例患者符合入選標準，治療前均未發現3TC耐藥。治療過程中，有29例患者檢出3TC耐藥，其中7例患者在兩個不同的隨訪點檢出耐藥。29例患者中，有9例治療前HBV DNA陰性，3例患者是治療12個月時檢出耐藥。與非耐藥患者相比，耐藥患者HBeAg陽性的比例更高(65.5% 比33.3%，P=0.001)，基線HBV DNA水平更高(7.49拷貝/ml 比 6.59拷貝/ml，P=0.017)，使用3TC時間明顯延長(40個月比26.5個月，P<0.001)。3TC耐藥模式有四種：rtM204I (n=7)、rtL180M (n=2)、rtL180M+rtM204V/I(n=23) 和rtL80V+rtM204I (n=4)。 結論 本地區AIDS/CHB合并感染患者對3TC耐藥率低。治療前HBV DNA陰性患者亦可較早出現耐藥。

人類免疫缺陷病毒(HIV)和乙型肝炎病毒(HBV)有相似的傳播途徑，兩者合并感染相當常見。我國HIV患者中，HBsAg陽性率為14.6 %[1]。特殊人群中，合并感染率更高[2]。因此，HIV/HBV合并感染患者的治療和耐藥問題不容忽視。

拉米夫定(lamivudine,3TC)是我國艾滋病診療常規中推薦的一線抗病毒治療藥物。3TC不但可以抑制HIV逆轉錄酶，也能抑制HBVDNA聚合酶。3TC治療HIV的用量為300mg/d，治療HBV單一感染用量為100mg/d。3TC治療HBV的耐受性良好，但隨用藥時間延長，因HBV的變異導致的耐藥逐漸增加。本研究以長期接受含3TC(300mg/d)的抗病毒方案治療艾滋病(AIDS)/慢性乙型肝炎(CHB)合并感染患者為對象，檢測患者治療前和治療后不同時間HBVDNA的含量，了解3TC的耐藥情況，為臨床醫師合理用藥提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集廣州市第八人民醫院2005年至2010年門診或住院隨訪的HIV患者的資料。研究對象入選標準為：①經WesternBlot確診HIV抗體陽性(廣州市疾病預防控制中心)；②HBsAg陽性超過6個月；③HAART方案中含有3TC300mg/d，使用6個月以上；④HAART前或隨訪過程中未使用其他抗HBV的藥物；⑤有血清標本保留。排除標準：合并其他肝炎病毒感染。入選患者丙氨酸轉移酶(ALT)的檢測上限為40U/L。研究通過廣州市第八人民醫院倫理委員會審查。

1.2 方法

1.2.1 檢測HBVDNA:檢測患者抗病毒治療前和治療滿12個月、24個月、36個月和48個月和60個月的HBVDNA水平，檢測試劑購自中山大學達安基因股份有限公司，HBVDNA檢測下限為500拷貝/ml。

1.2.2 提取HBVDNA:對HBVDNA陽性的標本，使用Qiagen血清DNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)按說明書步驟提取HBVDNA。

1.2.3 巢式PCR擴增HBVRT區:設計PCR引物，引物擴增范圍為nt45-ntl291。設計的引物送英濰捷基(上海)貿易有限公司合成。第一輪擴增范圍是nt45-nt1291，引物為5’-GCCTRTATTTTCCTGCTGGTGGCTCCAG-3’(nt45-72)和 5’-TCCAGACCKGCTGCGAGCAAAAC-3’(nt1291-1313)。第二輪擴增范圍為nt50-nt1264，引物為 5’-TATTTTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTC-3’(nt50-75)和5’-GTTCCGCAGTATGGATCGGCAGAGG-3’(nt1255-1279)。PCR反應條件為：預變性 94 ℃×3min, 變性94 ℃、 30s,退火55 ℃、30s,延伸72 ℃、70s，均為30個循環；后延伸72 ℃、 10min。PCR產物電泳，有目的條帶的產物送英濰捷基(上海)公司測序。

1.2.4 確定HBV基因型:使用Chromas和Contig軟件對測序結果進行序列拼接。從基因庫中選擇HBV基因型的標準株(A-H)，構建進化樹，根據進化樹中的遺傳距離分出HBV基因型。

1.2.5 耐藥分析:使用BioEdit軟件進行序列處理，分析AIDS/CHB合并感染患者抗病毒治療前和各隨訪點HBV變異情況。

1.3 統計學方法 數據采用SPSS16.0軟件包處理。計量資料用中位數(四分位間距)[M(IQR)]表示，計數資料以例(%)表示。正態分布計量資料的比較采用t檢驗，非正態分布計量資料的比較采用非參檢驗，計數資料的比較采用卡方檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者一般資料 符合入選標準的患者有185例，其中男性120例(64.9 %)、女性65例(35.1 %)，年齡中位數為38歲(IQR，33-48歲)。HIV感染的主要途徑為異性性傳播，有150例(81.1 %)。HBeAg陽性患者71例(38.4%)。ALT中位數為31U/L(IQR，21-50U/L)，AST中位數為38U/L(IQR，27-58U/L)，抗病毒治療前HBVDNA陽性患者115例(62.2%)，HBVDNA中位數為6.76log10拷貝/ml(IQR，5.05-7.75log10拷貝/ml)。HBV基因B型92例，C型32例。CD4+淋巴細胞計數中位數為45cells/mm3(IQR，12-124cells/mm3)。3TC使用時間中位數為27個月(IQR，17個月-41個月)。

2.2 拉米夫定耐藥情況

2.2.1 拉米夫定耐藥率:185例患者治療前均未發現3TC耐藥。治療過程中，出現3TC耐藥的有29例。其中7例患者在兩個隨訪點檢出耐藥，即有36份標本檢出耐藥。有患者在檢出HBVDNA陽性時，并未發現HBV的耐藥變異(見圖1)。

29例耐藥患者中9例患者治療前HBVDNA陰性，其中3例是治療12個月時出現耐藥、3例是治療24個月時出現耐藥、2例是治療36個月時出現耐藥、1例是治療48個月時出現耐藥。3TC使用時間與HBV DNA陽性率和3TC耐藥率的關系見圖1。

表1 3TC耐藥患者與非耐藥患者臨床特征的比較

注： ALT為丙氨酸氨基轉移酶

Note：ALT is alaninea minotransferase

圖1 3TC使用時間與HBV DNA陽性率和3TC耐藥率的關系 Fig.1 Relationship between the time of 3TC therapy and the rate of HBV DNA positive and 3TC resistance mutations

2.2.2 拉米夫定耐藥相關因素:比較耐藥患者和無耐藥患者基線HBV DNA等情況，兩者在HBeAg陽性比例、基線HBV DNA水平、3TC使用時間和HBV基因型方面存在統計學差異。耐藥患者HBeAg陽性的比例更高(65.5% 比33.3%，P=0.001)，基線HBV DNA水平更高(7.49 log10拷貝/ml 比 6.59 log10拷貝/ml，P=0.017)，使用3TC時間明顯延長(40個月比26.5個月，P< 0.001)，HBV 基因B型的比例較C型高(93.1 % 比68.4 %，P=0.008)。兩組在年齡、性別、基線ALT水平、治療前HBV DNA陽性比例和基線CD4+水平方面無統計學差異(見表1)。

2.2.3 拉米夫定耐藥模式:36份耐藥標本，耐藥模式有四種：rtM204I (n=7)， rtL180M (n=2)，rtL180M + rtM204V/I (n=23)和rtL80V + rtM204I (n=4)。

3 討論

3TC是第一個用于抗HBV治療的口服核苷(酸)類似物(NAs)，不僅有強大的抑制HBV復制的作用，亦能顯著延緩肝病進展和減少肝癌的發生[3]。3TC治療HBV的耐藥率隨使用時間的延長而增加。Gu等[4]研究了50例使用3TC 300 mg/d治療的HIV/HBV合并感染患者，96周后，10例(20%)患者可以檢測到HBV DNA的復制，其中8例出現3TC的耐藥突變。本研究中，3TC 耐藥率不高，可能與以下因素有關：首先，可能與HBV基因型有關，本研究中，HBV基因型是B型和C型，Iacomi等[5]認為HBV基因A型和HIV感染是HBV發生rtM204V的獨立危險因素。其次，還可能與HBeAg狀態有關。本研究中的合并感染患者，一半以上(61.1 %)為HBeAg陰性患者。Wongprasit等[6]研究顯示，HBeAg陰性是3TC 耐藥的一個保護因素。最后，可能與研究入選標準不同有關，前面提及的研究，入選病例均為治療前HBV DNA陽性患者，而本研究觀察的是接受HAART的患者，不論其抗病毒治療前HBV DNA水平如何，均為3TC 耐藥的觀察對象，不少患者在治療前的HBV DNA是陰性的。

本研究顯示，出現3TC耐藥的患者中，有9例在抗病毒治療前HBV DNA是陰性的，在治療后也出現HBV位點的變異。其中有3例是治療12個月時檢出耐藥。這就提示，即使是抗病毒治療前HBV DNA陰性的病例，在治療過程中，仍有可能較早出現3TC的耐藥。這與Kim等[7]的研究結果不一致，在Kim等的研究中，基線HBV DNA水平低的HIV/HBV合并感染患者，并未觀察到3TC的耐藥。本研究結果說明對HIV/HBV合并感染患者，不論抗病毒治療前HBV DNA水平如何，均應加強耐藥監測，以防耐藥株的傳播。

本研究中，也有部分患者檢出病毒復制，但無發現HBV耐藥變異位點。這可能與患者治療依從性有關，也可能是其他的原因。Hongthanakorn等[8]研究了148例接受NAs治療的CHB患者，有10例患者出現病毒學突破時，未檢出耐藥突變，繼續治療，也未檢出耐藥突變。因此作者認為，在NAs治療過程中，病毒學突破是常見的臨床表現，但并不是所有的病毒學突破都由病毒耐藥突變引起。

綜上所述，本地區AIDS/CHB合并感染患者對3TC耐藥率低。治療前HBV DNA陰性患者亦可較早出現耐藥。本研究尚存在不足，如對患者HBV DNA的檢測頻率不夠，因此不能更精確發現患者最早出現耐藥的時間和耐藥的變化規律；治療滿48個月和60個月的病例數較少。

[1] Wang HL, Li YJ, Zhang CD, et al. Immunological and virological responses to cART in HIV/HBV co-infected patients from a multicenter cohort [J]. AIDS, 2012, 26(14): 1755-1763. doi: 10.1097/QAD.0b013e328355ced2.

[2] 熊素平, 陳凱, 劉娜, 等. 天津某區特殊人群HIV感染者合并HBV、HCV、HGV、TB感染的調查分析[J].中華實驗和臨床病毒學雜志,2015,29(1): 47-49. doi:10.3760/ema.j.issn.1003-9279.2015.01.016.

[3] Liaw YF, Sung JJ, Chow WC, et al. Lamivudine for patients with chronic hepatitis B and advanced liver disease [J]. N Engl J Med, 2004, 351(15):1521-1531.doi: 10.1056/NEJMoa033364.

[4] Gu L, Han Y, Li Y, et al. Emergence of lamivudine-resistant HBV during antiretroviral therapy including lamivudine for patients coinfected with HIV and HBV in China [J]. PLoS One, 2015, 10(8):e0134539. doi: 10.1371/journal.pone.0134539.

[5] Iacomi F, Vincenti D, Vairo F, et al. Effect of HIV co-infection on mutation patterns of HBV in patients with lamivudine-resistant chronic hepatitis B [J]. J Med Virol, 2009, 81(7):1151-1156. doi: 10.1002/jmv.21505.

[6] Wongprasit P, Manosuthi W, Kiertiburanakul S, et al. Hepatitis B Virus Drug Resistance in HIV-1-Infected Patients Taking Lamivudine-Containing Antiretroviral Therapy [J]. AIDS Patient Care and STDs, 2010,24(4):205-209. doi: 10.1089/apc.2009.0322.

[7] Kim HN, Scott J, Cent A, et al. HBV lamivudine resistance among hepatitis B and HIV coinfected patients starting lamivudine, stavudine and nevirapine in Kenya [J]. J Viral Hepat, 2011, 18(10): e 447-e 452. doi: 10.1111/j.1365-2893.2011.01466.x.

[8] Hongthanakorn C, Chotiyaputta W, Oberhelman K, et al. Virological breakthrough and resistance in patients with chronic hepatitis B receiving nucleos(t)ide analogues in clinical practice [J]. Hepatology, 2011, 53(6):1854- 1863. : 10.1002/hep.24318.

Analysis on lamivudine resistance mutations of patients with AIDS/CHB co-infection

HuangSimin,CaiWeiping,HuFengyu,LiaoBaolin,LanYun,ChenYoupeng,TangXiaoping.

TheFirstHospitalAffiliatedJinanUniversity,Guangzhou510630,China(HuangSM,ChenYP);Guangzhou8thPeople’sHospital,Guangzhou510060,China(CaiWP,HuFY,LiaoBL,LanY,TangXP)

TangXiaoping,Email:xiaopingtanggz@yahoo.com

ObjectiveToinvestigatetheprevalenceandpatternsoflamivudine(3TC)resistancemutationsinacquiredimmunedeficiencysyndrome(AIDS)/chronichepatitisB(CHB)co-infectedpatientsreceiving3TCasapartofantiretroviraltherapy.MethodsDataofpatientswithAIDS/CHBco-infectionfrom2005to2010werecollected.HBVDNAwastestedatthetimeofhighlyactiveantiretroviraltherapy(HAART)andafter12, 24, 36, 48and60monthstherapy.HBVreversetranscriptase(RT)wasamplifiedindetectablesamples. 3TCresistancemutationswereidentified.Results185co-infectedpatientswereenrolled. 3TCresistancemutationswerenegativeatthetimeofHAART. 3TCresistancemutationsoccurredin29co-infectedpatientsaftertreatment,ofthese, 7patientsweredetectedresistancemutationsintwodifferentpoints. 9patientswereHBVnon-viraemiaatthetimeofantiviraltherapy.Resistancemutationsweredetectedafter12monthstherapyin3patients.Patientswith3TCresistancemutationsweremorefrequentlyHBeAgpositive(65.5%vs. 33.3%, P=0.001),hadhigherHBVviralload(7.49copies/mlvs. 6.59copies/ml, P=0.017)andlongerdurationof3TC(40monthsvs. 26.5months, P<0.001)thanpatientswithout3TCresistancemutations.Fourpatternsof3TCresistancemutationsweredetected:rtM204I(n=7),rtL180M(n=2),rtL180M+rtM204V/I(n=23)andrtL80V+rtM204I(n=4).ConclusionsTheprevalenceof3TCresistancemutationsislowamongAIDS/CHBco-infectedpatientsinGuangzhou.PatientswithHBVDNAnegativebeforeHAARTarelikelytodevelopresistanceearlyduringtherapy.

AIDS;HepatitisB,Chronic;Co-infection;Lamivudine;Resistancemutations

唐小平，Email: xiaopingtanggz@yahoo.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.05.014

艾滋??；肝炎，乙型，慢性；合并感染；拉米夫定；耐藥

2015-04-06)