百尾參多糖的提取工藝及抗氧化性評價

曹劍鋒??+任朝輝??+蘆靜波??+王自布??+夏慧芳??+夏麗莎??+劉丹

摘要：水提醇沉法提取百尾參多糖，以多糖得率為指標，考察提取時間、提取溫度、料液比、提取次數對多糖提取量的影響，在單因素試驗基礎上以正交試驗優化提取工藝參數。通過測定百尾參多糖清除1，1-二苯基-2-苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和·OH自由基能力、還原力及螯合力來評價其抗氧化活性。結果表明，百尾參多糖水提取的最佳工藝條件為提取溫度100 ℃、提取時間4 h、料液比1 g ∶[KG-3]50 mL、提取次數4次，在此條件下，百尾參多糖的提取率為15.68%，以正交試驗極差分析得出，溫度對百尾參粗多糖提取影響最大。百尾參多糖清除DPPH自由基和·OH自由基、還原力及螯合力的IC50值分別是4.8、1.8、3.9、0.24 mg/mL，百尾參多糖具有顯著體外抗氧化活性。

關鍵詞：百尾參；多糖；提??；抗氧化

中圖分類號： R284.2文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0343-04

百尾參為百合科（Liliaceae）萬壽竹屬（Disporum）植物萬壽竹[Disporum cantoniense（Lour.）Merr.]的根及根莖，別稱白味參、白龍須等。百尾參為多年生草本藥用植物，在中國南北均有分布，具有潤肺止咳、健脾消積的功效，傳統用于虛損咳喘、痰中帶血、腸風下血、食積脹滿等癥狀[1-2]。以百尾參為主藥的市售復方制劑有貴州百靈生產的咳速停系列藥物。陳磊等對其化學成分研究發現，百尾參含有多種活性成分，如黃酮類化合物以及糖苷類化合物、萜類以及揮發油、有機酸等[3-6]?，F代藥理學研究表明，百尾參具有止咳、抗菌、抗炎等多種藥理作用[7-8]；關于百尾參多糖提取的工藝研究未見報道。本研究以百尾參為原料，水提醇沉法提取多糖。在單因素試驗基礎上以正交試驗對百尾參多糖提取工藝進行優化，通過測定百尾參多糖清除1，1-二苯基-2-苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和·OH自由基能、還原力及螯合力來評價其抗氧化活性。為百尾參多糖在食品及相關領域的開發利用提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

百尾參藥材采自貴州省安順市，經貴州師范學院鑒定為百合科（Liliaceae）萬壽竹屬（Disporum）植物萬壽竹[Disporum cantoniense（Lour.）Merr.]；ferrozine，DPPH，梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；95%乙醇溶液、苯酚、濃硫酸、鐵氰化鉀、氯化亞鐵、葡萄糖、磷酸氫鉀、維生素C等均為國產分析純。

恒溫水浴鍋，上海梅香儀器有限公司生產；真空抽濾機，鄭州長城科工貿有限公司生產；電子天平，上海精密科技儀器有限公司生產；凍干機，河南兄弟儀器設備有限公司生產；分光光度計，上海精密科技儀器有限公司生產；離心機，江蘇正基儀器有限公司生產；干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司生產。

1.2方法

1.2.1水提醇沉提取工藝

百尾參干粉→蒸餾水浸提 →4 000 r/min 離心10 min→上清→減壓濃縮至原體積10%→4倍體積乙醇醇沉→3 500 r/min離心10 min→沉淀物→洗滌→百尾參粗多糖。

1.2.2多糖得率測定與計算

多糖含量以苯酚-硫酸法測定[9]。以干燥至恒質量的葡萄糖配制標準液，于490 nm波長處測得的吸光度，繪制標準曲線，得葡萄糖標準曲線方程，計算多糖得率：

[JZ]提取率=[SX（]比色液濃度（μg/mL）×稀釋倍數×250〖〗供試樣品質量（g）×106[SX）]×100%。

1.2.3單因素試驗和正交試驗設計

參照楊林等的方法[10]設置單因素試驗：考察提取溫度、提取時間、料液比、提取次數對多糖提取率的影響。并對多糖提取率進行計算，每組試驗重復3 次。

在單因素試驗的基礎上，以百尾參多糖提取率（Y）為響應值，提取溫度（A），提取時間（B），料液比（C）、提取次數（D）為試驗因素，在4因素3水平上對百尾參多糖提取工藝進行優化，正交試驗因素水平見表1。

1.2.4多糖純化

將百尾參粗多糖以活性炭脫色、saveage法脫蛋白，經醇沉后透析、冷凍干燥[11-12]；即得到純化后的熱水浸提的多糖。此純化的多糖用于后續抗氧化活性評價試驗。

1.2.5多糖的抗氧化活性

1.2.5.1 DPPH 清除活性測定

參照韋獻雅等的方法[13-14]，稍有改動，用95%乙醇配制濃度為2×10-4 mol/L的 DPPH溶液。取“1.2.4”節制備的多糖樣品配制40、80、160、320、640、1 280、2 000 μg/mL百尾參糖溶液，在8支試管中分別加入各質量濃度的樣品糖溶液和蒸餾水2 mL，精確加入2 mL DPPH溶液，混勻30 min后517 nm測定吸光值，以維生素C為對照，每份樣品平行操作3 次，根據公式（1）計算DPPH清除率：

[JZ（]DPPH清除率=（D0-D樣品）/D0×100%。[JZ）][JY]（1）

式中：D0為2 mL DPPH溶液與2 mL蒸餾水混合后的吸光度；D樣品為2 mL DPPH乙醇溶液與樣品混合后的吸光度。

1.2.5.2清除·OH能力的測定

參照葛霞等、吳向陽等的方法[15-16]，取“1.2.4”節制備的多糖樣品配制80、160、320、640、1 280、2 560、4 000 μg/mL的糖樣品溶液，在8支10 mL的試管中分別加入3 mmol/L的FeSO4溶液1 mL，3 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL，0.05%的H2O2溶液1 mL，立即混勻，再分別加入各質量濃度樣品糖溶液1 mL，蒸餾水管為空白對照。37 ℃反應30 min后510 nm測量吸光度。以維生素C為對照，每份樣品平行操作3 次，根據公式（2）計算·OH清除率：

[JZ（]清除率=（D0-D樣品）/D0×100%。[JZ）][JY]（2）

式中：D0為空白對照液的吸光值；D樣品為加入不同濃度糖溶液的吸光值。

1.2.5.3Fe2+螯合能力的測定

參照文獻[17]的方法將 “12.4”節制備的多糖樣品配制成80、160、320、640、1 280、2 560、4 000 μg/mL的溶液，在9支試管中分別再加入3.7 mL 蒸餾水，0.1 mL 2 mmol的FeCl2溶液，分別加入各質量濃度樣品液1 mL，混合均勻后加入0.2 mL 5 mmol/L的ferrozine啟動反應，空白管為不加糖液蒸餾水管，標準管用蒸餾水代替FeCl2溶液，室溫放置30 min后562 nm處測定吸光度，以EDTA 做對照，每份樣品平行操作3 次。根據公式（3）計算金屬螯合能力（%）：

[JZ（]金屬螯合能力=[D0-（D樣品-D標準）]/D0×100%。[JZ）][JY]（3）

式中：D0為空白對照的吸光值；D樣品為加入不同濃度糖溶液的吸光值；D標準為蒸餾水代替FeCl2溶液的吸光值。

1.2.5.4總還原能力的測定

參照文獻[18]的方法加以適當改進，在8支試管中分別加入0、80、160、320、640、1 280、2 560、4 000 μg/mL “1.2.4”節制備的多糖樣品溶液0.2 mL，再加入0.5 mL磷酸緩沖液（0.2 mol/L，pH值6.6）和0.5 mL 1%鐵氰化鉀?；靹蚝笤?0 ℃放置20 min，加入0.5 mL 10%三氯乙酸后3 000 r/min離心10 min，吸取上清液1 mL，加入1 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵，混勻后在700 nm波長下測定吸光度D。以維生素C為對照。平行測定3次。

2結果與分析

2.1葡萄糖標準曲線

對葡萄糖標準溶液與對應的吸光度，繪制葡萄糖標準曲線，擬合線性方程為y=0.016 11x，r2=0.9992，可根據方程計算多糖得率。

2.2單因素試驗

2.2.1料液比對粗多糖提取率的影響從圖1可以看出，開始隨著料液比的增加，多糖的得率隨之增加，當料液比為1 g ∶[KG-3]60 mL 時多糖得率達到最高，隨后隨著料液比的繼續增加，多糖提取得率并沒有明顯增加，并稍呈下降趨勢。

2.2.2溫度對粗多糖提取率的影響從圖2可以看出，起初隨著溫度的升高，百尾參多糖的得率相應增加。當溫度達到90 ℃時多糖提取率達到最高，到100 ℃時則稍有降低。

2.2.3時間對粗多糖提取率的影響從圖3可以看出，隨著時間延長，百尾參多糖的得率增加，3.0 h達到最高值，當提取時間大于3.0 h時，多糖的得率有所下降。

2.4.2DPPH自由基清除能力從圖6可以看出，百尾參多糖對DPPH自由基具有一定的清除作用，其清除能力隨樣品質量濃度增加而增強（半數抑制濃度IC50為8.4 mg/mL），相比之下百尾參多糖對DPPH自由基的清除作用較維生素C弱。

2.4.3百尾參多糖的金屬螯合力從圖7可以看出，百尾參多糖在較小濃度時隨著質量濃度增加對金屬的螯合力迅速升高，當多糖質量濃度為0 .32 mg/mL時，對金屬螯合力達80%以上，顯示了較強的螯合金屬離子或惰化金屬離子的能力，IC50值為0.24 mg/mL。

2.4.4百尾參多糖的還原能力從圖8可以看出，維生素C的吸光度隨著質量濃度的增加明顯上升，與維生素C的吸光度相比白尾參多糖隨濃度增加吸光度增加緩慢，但呈現較好的量效關系，表明還原能力逐漸增強，抗氧化能力也增強。IC50為3.9 mg/mL。

3結論

通過正交設計得出百尾參多糖的最佳工藝條件為：提取溫度100 ℃，提取時間4 h，提取次數4次，料液比 1 g ∶[KG-3]50 mL，在此條件下多糖得率15.68%，該優化結果對百尾參多糖開發利用和生產有重要的參考價值。體外抗氧化試驗結果表明，百尾參多糖對羥自由基和DPPH自由基都有一定的清除能力，且具有一定的還原力和較強的金屬螯合能力，表明百尾參多糖具有較好的抗氧化活性。因而百尾參多糖在天然抗氧化劑和功能食品的開發方面都有良好的應用潛力。

參考文獻：

[1]邱德文，杜江. 中華本草（苗藥卷）[M]. 貴陽：貴州科技出版社，2005：54-55.

[2]貴州省藥品監督管理局.貴州省中藥材：民族藥材質量標準[M]. 2003年版. 貴陽：貴州科技出版社，2003：162.

[3]吳文利，張雁萍，王道平，等. 野生和人工栽培百尾參揮發油GC-MS分析[J]. 貴陽醫學院學報，2011，36（3）：255-258.

[4]甘秀海，趙超，梁志遠，等. 百尾參化學成分研究[J]. 貴州師范大學學報：自然科學版，2014，32（1）：64-66.

[5]陳磊. 百合科兩種藥用植物化學成分及生物活性研究[D]. 天津：天津大學，2009.

[6]Chen L，Su Y F，Yin Z Y，et al. Flavonoids from Disporum cantoniense（Liliaceae）[J]. Biochemical Systematics and Ecology，2009，37（5）：609-612.

[7]任朝輝，曹劍鋒，夏麗莎，等. 百尾參祛痰止咳、抗炎作用研究[J]. 安徽農業科學，2015，43（11）：116-118.

[8]甘秀海，梁志遠，王瑞. 百尾參抑菌活性研究[J]. 貴陽學院學報：自然科學版，2012，7（1）：43-44，52.[HJ1.73mm]

[9]王文平，郭祀遠，李琳，等. 苯酚-硫酸法測定野木瓜中多糖含量的研究[J]. 食品科學，2007，28（4）：276-279.[ZK）]

[10]楊林，劉翠花，劉剛，等. 西藏野生尊麻水溶性多糖提取工藝的優化設計[J]. 食品工業科技，2013，34（2）：35-37.

[11]Chen Y，Xie M Y，Li W J，et al. An effective method for deproteinization of bioactive polysaccharides extracted from lingzhi（Ganoderma atrum）[J]. Food Science and Biotechnology，2012，21（1）：191-198.

[12]程超，李偉，汪興平. 平菇水溶性多糖結構表征與體外抗氧化作用[J]. 食品科學，2005，26（8）：55-57.

[13]韋獻雅，殷麗琴，鐘成，等. DPPH法評價抗氧化活性研究進展[J]. 食品科學，2014，35（9）：317-322.

[14]Li W，Liang H，Zhang M W，et al. Phenolic profiles and antioxidant activity of litchi（Litchi chinensis Sonn.）fruit pericarp from different commercially available cultivars[J]. Molecules，2012，17（12）：14954-14967.

[15]葛霞，陳婷婷，蔡教英，等. 青錢柳多糖抗氧化活性的研究[J]. 中國食品學報，2011，11（5）：59-64.

[16]吳向陽，范群艷，仰榴青，等. 匙羹藤粗多糖的提取及其清除羥自由基活性研究[J]. 食品科學，2008，29（1）：107-110.

[17]楊少輝，宋英今，王清華，等. 雪蓮果體外抗氧化和自由基清除能力[J]. 食品科學，2010，31（17）：166-169.