JAM—A在甲狀腺乳頭狀癌診斷及臨床預后中的應用價值

傅燕萍　范乘龍　孟麗

[摘要] 目的 觀察連接黏附分子A（junctional adhesion molecule A，JAM-A）在人甲狀腺乳頭狀癌和正常甲狀腺組織中的表達情況，初步探討其表達與臨床病理特征之間的關系，進一步觀察其表達與淋巴轉移的關系。 方法 通過免疫組織化學染色法檢測120例甲狀腺乳頭狀癌組織和60例正常甲狀腺組織中JAM-A蛋白的表達情況。結果 JAM-A在正常甲狀腺組織、不伴有淋巴結轉移的原發甲狀腺癌組織、伴隨有淋巴結轉移的原發甲狀腺癌組織中的陽性表達率逐漸降低。JAM-A在甲狀腺乳頭狀癌組織和正常甲狀腺組織間比較，差異有統計學意義（P<0.05）；JAM-A在伴隨有淋巴結轉移的原發甲狀腺癌組織和不伴有淋巴結轉移的原發甲狀腺乳頭狀癌組間比較，差異有統計學意義（P<0.05）。 結論 JAM-A的表達與甲狀腺乳頭狀癌惡性程度密切相關，隨著出現淋巴結的轉移，其表達逐漸降低，與其呈負相關，因此JAM-A在甲狀腺乳頭狀癌的治療決策、預后評估中具有重要的應用價值。

[關鍵詞] 甲狀腺乳頭狀癌；連接黏附分子A；轉移；預后

[中圖分類號] R736.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）31-0005-05

目前甲狀腺乳頭狀癌并頸部淋巴結轉移是決定外科醫生甲狀腺癌手術方式的重要因素之一。而近來不同種細胞黏附分子在不同惡性腫瘤浸潤、侵襲和轉移中所扮演的角色不同，連接黏附分子（junction adhesion molecule，JAM）在細胞間的連接有極其重要的意義，國外研究表明JAM在體內外保持細胞內環境穩態、新生血管生成、腫瘤侵襲、遠處轉移及周邊浸潤等眾多病理生理過程中均扮演著極其重要的角色[1]。然而目前JAM在原發性甲狀腺乳頭狀癌中的表達及其重要臨床預后意義仍未被闡述清楚，JAM表達是否與淋巴結轉移或遠處轉移有關系仍然未知。本文主要目的是通過免疫組化檢測法進一步闡明連接黏附分子A（junctional adhesion molecule A，JAM-A）在原發性甲狀腺乳頭狀癌中的蛋白表達情況，并且進一步分析JAM-A表達與甲狀腺乳頭狀癌是否伴有淋巴轉移之間的聯系?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料

通過回顧性收集紹興市中心醫院（中國醫科大學紹興醫院）病理科2010年1月～2015年12月期間診斷的甲狀腺病變組織180例，均為病理科存檔標本，180例樣本中包括120例甲狀腺乳頭狀癌和60例正常甲狀腺組織。本研究經過紹興市中心醫院倫理委員會集體討論通過，獲得患者的知情同意并且簽署知情同意書。60例正常甲狀腺組織的患者中，男30例，女30例，年齡<45歲30例，年齡≥45歲30例，JAM-A在不同年齡組與性別組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。120例甲狀腺乳頭狀癌中，女92例，男28例；年齡18～76歲，中位年齡48歲；腫瘤直徑0.1～5.0 cm，其中瘤體直徑<3.0 cm者96例，瘤體直徑≥3.0 cm者24例；24例腫瘤合并包膜浸潤；40例同時伴有頸部或中央區淋巴結轉移，另外80例乳頭狀癌患者無淋巴結轉移；按照腫瘤國際臨床疾病分期進行重新分類，腫瘤的TNM分期按照AJCC提出的標準進行確定?；颊咛幱赥NMⅠ期54例，TNMⅡ期26例，TNM Ⅲ期40例，JAM-A在不同年齡組、性別、腫瘤直徑、是否包膜侵犯、癌灶數量、與臨床分期比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 實驗方法

采用免疫組織化學SP染色方法，進行染色標記JAM-A抗體。具體操作過程如下：（1）標本均經過石蠟切片、脫蠟和水化三重HE標本制作全部標準流程后，利用新配置的蒸餾水沖洗3次已經制備好的切片，每次沖洗玻片3 min；（2）使用3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶，室溫下孵育8 min或水浴箱孵育3 min左右；（3）接著以上步驟用新配置的蒸餾水沖洗2次，每次大約5 min，然后放置在高溫壓力鍋中進行組織抗原的修復，用新配置的PBS液體（pH 7.4）沖洗3遍，每次沖洗3 min；（4）在室溫下在玻片上小心滴加4%羊血清封閉 30 min，盡量減少組織的非特異性染色；（5）載玻片上滴加一抗，室溫孵育60 min；（6）然后用新配置的PBS緩沖液體沖洗3次，每次沖洗4 min，利用滴加二步的方法MaxvisionTM/HPR孵育15 min；（7）利用PBS緩沖液體沖洗載玻片3次，平均每次5 min。（8）輕輕甩去PBS液體，滴加新鮮配制的DAB顯色液2～5 min左右，最后在光學顯微鏡下觀察染色情況，抗體的陽性信號為棕黃色或棕褐色顆粒著色，著色定位在細胞胞質中。染色顯色的時間為3 min左右，然后終止該反應，用自來水充分沖洗切片。進行蘇木素復染后，用0.1%鹽酸酒精分化，然后自來水沖洗5 min左右。通過不同梯度的酒精進行脫水，二甲苯液體進行透明，最后利用中性樹膠進行封片。高年資病理醫師閱片并判讀確定染色的最終結果，然后討論并分析JAM-A在不同組種的表達情況及其不同組間的相互關系。

1.3結果判定與分析

免疫組織化學染色標記的結果最后由本單位2位副主任醫師和外單位病理科2位主任醫師分別進行雙盲閱片，按照給定的評分標準評分，最終統計4位醫師的結果均一致者作為最后的統計結果。免疫組織化學評分標準主要有兩種，分別按照陽性強度評分和陽性細胞占所有細胞的比例進行評分。JAM-A蛋白免疫組化染色定位在細胞胞質中著色，免疫組化結果判定按照Sun W等[3]文獻中給出的評分方法：（1）根據細胞的染色強度評分：病變區域細胞無染色為 0分；呈淡黃色顆粒染色、明顯高于切片組織背景著色評分為 1分；病變組織呈淺棕黃色顆粒時將其結果評分為2分；病變組織中存在大量深棕黃色顆粒時將其免疫組化結果評分為3分；（2）按照陽性細胞數的計數評分：將每張制作的切片不同觀察者間隨機觀察至少10個左右的高倍視野（10個/HPF），計數染色細胞數的陽性百分比例，1%～24%評分為1分；25%～49%評分為2分；50%～75%評分為3分；>75%評分為4分。（3）結合以上兩個步驟后，將染色強度評分與陽性細胞數比例的評分取其之和，如果總評分相加評分<2分為陰性（-），評分2～3分為弱陽性（+），最終評分結果4～5分者為中度陽性（++），最終評分結果6～7分者為強陽性（+++）。

1.4 統計學分析

通過采用 SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析。本文所有統計資料均為計數資料，采用χ2檢驗，當P<0.05時差異有統計學意義。

2 結果

2.1 JAM-A在正常甲狀腺組織和乳頭狀癌中的表達

SP免疫組化判讀結果最終表明JAM-A在正常甲狀腺組織濾泡腺上皮細胞中和乳頭狀癌細胞的胞膜上均顯示有不同程度的蛋白表達，經過嚴格的統計得知JAM-A在正常甲狀腺組織的陽性表達率為90.0%（54/60），（++）～（+++）的表達率為77.8%（42/54）；JAM-A在甲狀腺乳頭狀癌中的表達率為60.0%（72/120）。以上結果顯示：JAM-A在正常甲狀腺組織中的陽性表達率明顯高于甲狀腺乳頭狀癌組；JAM-A在正常甲狀腺組織、甲狀腺乳頭狀癌組織間比較，差異有統計學意義（P<0.05）。JAM-A在不合并淋巴結轉移性甲狀腺乳頭狀癌組織中的陽性表達率為70.0%（56/80），（++）～（+++）的表達率為71.4 %（40/56）；JAM-A在合并有頸部中央區淋巴結甲狀腺乳頭狀癌轉移的癌組織中的陽性表達率為40.0%（16/40），其中（++）～（+++）的表達率為50.0%（8/16），JAM-A蛋白在伴隨有淋巴結轉移的原發甲狀腺癌組織和不伴隨有淋巴結轉移的甲狀腺癌組織中進行兩組組間比較，差異有統計學意義（P<0.05）。

總之，JAM-A在正常甲狀腺組織、無淋巴結癌轉移的甲狀腺乳頭狀癌組織、有淋巴結轉移的甲狀腺乳頭狀癌組織中陽性表達率依次降低，組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。JAM-A在甲狀腺不同組織中的表達情況見表1、封三圖4～7，其表達與患者的性別、年齡無關，差異無統計學意義（P>0.05），見表2。

2.2 JAM-A表達與不同組患者的臨床病理特征聯系

最終通過免疫組織化學染色結果判讀分析表明：120例甲狀腺乳頭狀癌中，JAM-A在合并有淋巴結轉移的組織中的陽性表達率為40.0%（16/40），在不合并淋巴結轉移組織中的陽性表達率為70.0%（56/80），兩者比較差異有統計學意義（P<0.05）；然而JAM-A蛋白在正常甲狀腺濾泡組織、伴有淋巴結轉移的研究組和不伴隨有淋巴結轉移的研究組間的表達，與患者的年齡、性別及瘤體的大小、是否同時合并包膜浸潤累犯情況、病灶數目的多少和TNM臨床分期均無相關性（表3）。以上結果表明JAM-A蛋白可能參與甲狀腺乳頭狀癌的侵襲、浸潤和轉移過程。

3 討論

甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺惡性腫瘤中最常見的腫瘤之一，盡管與其他器官的惡性腫瘤相比較，其惡性程度較低，然而甲狀腺乳頭狀癌容易發生局部復發和遠處轉移，有些乳頭狀癌的患者在疾病發現的早期甚至即可發生頸部淋巴結的多發轉移浸潤。因此，闡明甲狀腺乳頭狀癌容易發生侵襲、轉移發生的致病機制與病因，是目前根治甲狀腺癌的最關鍵舉措之一。目前伴隨細胞間黏附分子的發現，給腫瘤的治療和闡明其致病機制提供了重要的成果，近來大量的國外研究表明不同的細胞間黏附分子在維持人體內正常細胞間內環境的穩態過程中發揮十分重要的作用，扮演著相當重要的角色，細胞間黏附分子的不同程度表達與多種惡性腫瘤的浸潤、侵襲轉移和腫瘤原發部位的隨后短期復發有著相當密切的關系[2-5]，主要是由這些黏附分子扮演重要的角色，因此，科研工作者從基因蛋白的水平尋找發現可靠的、有臨床應用價值的甲狀腺乳頭狀癌的分子蛋白標志物，不僅能夠協助病理醫師診斷甲狀腺乳頭狀癌，而且對于臨床醫師選擇合理的外科手術方式有重要的意義；因此，發現新的有價值的標記物，并對于判斷患者的臨床預后就顯得更加重要。

惡性腫瘤細胞的浸潤、侵襲與轉移過程相當復雜。首先，許多上皮性惡性腫瘤中，癌細胞與癌細胞之間黏附分子的減少或丟失，或某種蛋白的表達缺失，或基因突變導致蛋白改變，是腫瘤侵襲浸潤轉移的關鍵步驟之一。癌細胞與癌細胞之間的黏附性降低，從而使癌細胞很容易脫離癌巢，從而脫離腫瘤發生的原始部位，這為癌細胞的遠處游走、周邊浸潤及侵襲和遠處轉移提供了便利的條件之一。目前國外的部分研究表明惡性腫瘤中，瘤細胞之間緊密連接的關鍵性通路遭到破壞是導致惡性腫瘤細胞發生早期侵襲、遷移及擴散的重要條件之一[6]。陳兆峰等[7]的研究結果表明，胃癌瘤細胞中COX-2可通過NF-κB/Snail信號通路，進一步下調鈣黏附分子（E-cadherin）的表達，從而促進胃癌細胞的浸潤侵襲并發生遠處轉移。另外，亦有研究發現JAM屬于免疫球蛋白超家族類的一員，是一種細胞間緊密連接的黏附分子，目前研究表明其主要包含JAM-A、JAM-B、JAM-C三個家族成員。許多研究證實JAM-A最先出現在細胞間接觸位點并能召集其他緊密連接蛋白從而啟動緊密連接的形成，這種特性賦予其能夠促進同型細胞間的連接[8-9]。JAM-A蛋白通?？芍苯幼饔糜诹鲶w鄰近的惡性腫瘤細胞，通過誘導促進基質蛋白酶釋放降解基質，并且通過水解腫瘤細胞表面的黏附分子而有助于腫瘤細胞的遷移和侵襲。另外，JAM-A蛋白能在信使RNA水平和蛋白表達水平直接反饋影響血管內皮生長因子、促血管生長因子的表達，從而進一步引起腫瘤新生血管的大量生成，從而增加惡性腫瘤的侵襲性及轉移能力。

多數研究表明惡性腫瘤細胞發生遷移這一導火線是惡性腫瘤發生浸潤和轉移必不可少的前提條件之一。JAM-A蛋白由于其能夠影響惡性腫瘤細胞的遷移，目前被廣泛應用于各種惡性腫瘤的侵襲、浸潤機制的基礎研究中，這可能為腫瘤發生轉移浸潤提供基礎支撐[10-11]。JAM-A蛋白通過不同途徑可促進惡性腫瘤的遷移轉移。李殿友等[12]研究發現人參皂苷Rh2可抑制小鼠腫瘤生長，可能與JAM-A低表達和JAM-B低表達密切相關，而對照組JAM-A和JAM-B明顯上調。另外JAM-A的表達下調可以促進某些腫瘤的轉移。例如在對肺的原發性鱗狀上皮細胞癌、乳腺浸潤性導管癌、子宮內膜樣腺癌和腎透明細胞癌等研究中發現，這些腫瘤中 JAM-A蛋白的表達下調，并與多種惡性腫瘤的惡性程度和轉移能力呈負相關[13]。當然亦有文獻報道，JAM-A蛋白表達上調同樣可以促進某些惡性腫瘤的遷移轉移，促進其惡性轉換，JAM-A可通過調節GTP Rap1酶的活性和β1-integrin的表達水平，進一步導致細胞極性的改變和癌變部位新生血管的生成，最終會導致乳腺癌、前列腺腺癌的擴散與轉移。由此可見，無論JAM-A的表達是上調還是下調，都可能會促進惡性腫瘤的浸潤與轉移[13-19]，而我們的研究中發現JAM-A的表達逐漸下降，與多數研究結果一致，說明其下調可能促進惡性腫瘤的進一步進展或惡性轉移。

本研究經過慎密的統計分析，結果表明：JAM-A蛋白在正常甲狀腺組織、不合并淋巴結轉移的甲狀腺乳頭狀癌組織、合并有淋巴結轉移的甲狀腺乳頭狀癌組織中陽性表達率呈現逐漸降低的趨勢，這一研究結果與當今絕大多數的研究成果相一致，具有非常重要的臨床意義。表明隨著甲狀腺乳頭狀癌疾病的惡性進展，JAM-A蛋白表達的下降可能引起緊密連接復合體減少或消失，信號通路進一步發生變化，內環境改變，進一步促進增加開放淋巴管的連接數目，為甲狀腺乳頭狀癌細胞的淋巴道或血道轉移創造了雙重便利條件，研究結果進一步表明JAM-A蛋白有希望成為判定人類甲狀腺乳頭狀癌轉移預后的重要指標之一，這為外科選擇合理的治療提供有力的理論依據，進一步為臨床輔助其后續治療提供便利條件。

總之，人體內正常細胞發生癌變是一個相當復雜的不斷進展的過程，要經過不斷的外在和內在刺激，超出了正常機體的修復范圍，另外與腫瘤細胞分裂過程中細胞周期的變化、不同信號轉導途經的異常、細胞內環境的改變、細胞骨架改變及異?；蛲蛔兊榷鄠€方面密切相關，而膜聯蛋白家族的所有成員幾乎被牽涉到惡性腫瘤中不同種瘤細胞的病理生理過程的多個環節[18-20]。近來有研究表明JAM-A作為膜聯蛋白家族一個極其特殊成員之一，在不同惡性腫瘤的多方面研究中受到國內外學者們的高度重視，很有可能成為原發性甲狀腺乳頭狀癌診斷與治療的靶點之一，為提高患者的生存率提供可靠的理論依據，但JAM-A在甲狀腺乳頭狀癌中的細胞水平的具體機制還需我們進一步去深入研究與發現，最終從機制上闡明其內在原因。

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（收稿日期：2016-07-05）