UPLC—MS/MS測定復方丹參方中丹參酮ⅡA、丹參酚酸B、人參皂苷Rg1及其在大鼠血漿和腦組織的藥代動力學研究

張杰+劉勝蘭+王慧+陽國平+李勁平+劉世坤+唐智+裴奇+黃攀豪

[摘要]建立大鼠血漿和腦組織中丹參酮Ⅱ_a（TSⅡ_a）、丹酚酸B（SAB）、人參皂苷Rg₁（GRg₁）的UPLC-MS/MS分析方法，并開展藥物動力學研究。選用SD大鼠，單劑量灌胃（ig）復方丹參方，采集血液與腦組織樣品，采用UPLC-MS/MS測定血漿和腦組織中TSⅡ_a、SAB和GRg₁的濃度，以Phoenix WinNolin 6.1藥動學程序軟件對數據進行非房室模型擬合，采用統計矩法計算藥動學參數。經方法學考證，3種成分的峰面積與其在血樣及腦組織中的濃度線性關系良好（r>0.992 2）；回收率為58.86%～112.1%，日內、日間RSD≤9.7%，準確度及穩定性均符合體內藥物分析的要求。大鼠ig給復方丹參方后的血漿藥動參數如下：丹參酮Ⅱ_atmax（1.58±0.081） h，Cmax（725.4±88.20） μg·L^-1，AUC0-t（2 101.3±124.85） μg·h·L^-1， MRT0-t（3.66±0.05） h；丹酚酸B tmax（1.29±0.21） h，Cmax（307.9±46.75） μg·L^-1，AUC0-t（537.4±88.24） μg·h·L^-1， MRTlast （2.08±0.11） h；人參皂苷Rg₁tmax（1.42±0.20） h，Cmax（460.38±154.60） μg·L^-1，AUC0-t（383.4±88.16） μg·h·L^-1， MRTlast （1.87±0.046） h。腦組織藥動參數如下：丹參酮ⅡA tmax（0.75±0.22） h，Cmax（1.41±0.420） ng·g^-1，AUC0-t（4.34±2.48） ng·h·g^-1， MRT0-t （4.00±1.90） h；丹酚酸B tmax（1.08±0.20） h，Cmax（21.09±4.850） ng·g^-1，AUC0-t（14.83±3.160） ng·h·g^-1， MRT0-t（0.99±0.08） h；人參皂苷Rg₁tmax（0.50±0.16） h，Cmax（130.96±54.220） ng·g^-1，AUC0-t（136.24±34.350） ng·h·g^-1， MRT0-t（2.87±0.33） h。該研究所建立的UPLC-MS/MS方法可用于大鼠血漿及腦組織中丹參酮Ⅱ_a、丹酚酸B、人參皂苷Rg₁中的藥動學研究。

[關鍵詞]UPLC-MS/MS； 丹參酮Ⅱ_a； 丹酚酸B； 人參皂苷Rg₁； 藥動學

[Abstract]A sensitive and specific ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry （UPLC-MS/MS） method was developed for analysis of tanshinone Ⅱ_a（TSⅡ_a）， salvianolic acid B（SAB） and ginsenoside Rg₁（GRg₁） in rat plasma and brain tissues. Male healthy Sprague-Dawley（SD） rats were orally given single dose of Fufang Danshen preparation （TS Ⅱ_a 60 mg·kg^-1， SAB 300 mg·kg^-1， GRg₁ 150 mg·kg^-1， borneol 300 mg·kg^-1）， and their blood samples and brain tissues were collected at different time points. The drug plasma and brain tissue concentrations of the three analytes were determined by UPLC-MS/MS method. Subsequently， the main pharmacokinetics parameters of plasma and brain tissues were calculated by using Phoenix WinNolin 6.1 software. The methodological test showed that all of analytes in both plasma and brain homogenate exhibited a good linearity within the concentration range（r>0.992 2）. Their mean recoveries were between 58.86% and 112.1%. Intra-day and inter-day precisions of the investigated components exhibited RSD≤9.7%， and the accuracy（RE） ranged from -9.68% to 8.20% at all quality control levels. The results of accuracy and stability meet the requirements for biopharmaceutical analysis. For TSⅡ_a， the pharmacokinetics parameters tmax， Cmax， AUC0-t， MRTlast in the plasma were （1.58±0.081） h， （725.4±88.20） μg·L^-1， （2 101.3±124.85） μg·h·L^-1 and （3.66±0.05） h， respectively. For SAB， the pharmacokinetics parameters tmax， Cmax， AUC0-t， MRTlast in the plasma were （1.29±0.21） h， （307.9±46.75） μg·L^-1， （537.4±88.24） μg·h·L^-1 and （2.08±0.11） h， respectively. For GRg₁， the pharmacokinetics parameters tmax， Cmax， AUC0-t， MRTlast in the plasma were （1.42±0.20） h， （460.38±154.60） μg·L^-1， （383.4±88.16） μg·h·L^-1 and （1.87±0.046） h， respectively. For TSⅡ_a， the pharmacokinetics parameters tmax， Cmax， AUC0-t， MRTlast in the brain tissue were （0.75±0.22） h， （1.41±0.42） ng·g^-1， （4.34±2.48） ng·h·g^-1 and （4.00±1.90） h， respectively. For SAB， the pharmacokinetics parameters tmax， Cmax， AUC0-t， MRTlast in the plasma were （1.08±0.20） h， （21.09±4.850） ng·g^-1， （14.83±3.160） ng·h·g^-1 and （0.99±0.08） h， respectively. For GRg₁， the pharmacokinetics parameters tmax， Cmax， AUC0-t， MRTlast in the plasma were （0.50±0.16） h， （130.96±54.220） ng·g^-1， （136.24±34.350） ng·h·g^-1 and （2.87±0.33） h， respectively. The developed method was successfully applied in pharmacokinetic studies on content of TS Ⅱ_a， SAB and GRg1 in rat plasma and brain tissues.

[Key words]UPLC-MS/MS； tanshinone Ⅱ_a； salvianolic acid B； ginsenoside Rg₁； pharmacokinetic

復方丹參方由丹參、三七和冰片3味中藥組成，活血化瘀，理氣止痛，被廣泛用于冠心病、心復絞痛、腦缺血再灌注損傷、腦缺血、阿爾茲海默病等^[1-3]，療效確切，《中國藥典》1977年版至2015年版均有收載，且已列入國家基本藥品目錄。研究表明，丹參主要有效成分為丹參酮Ⅱ_a、隱丹參酮等脂溶性丹參酮類和丹參酚酸B、丹參素等水溶性丹參酚酸類，對心肌缺血、腦缺血以及腦缺血再灌注損傷具有明顯的保護作用^[4]。三七皂苷R₁、人參皂苷Rg₁和Rb₁等三七皂苷類是三七的主要有效成分，具有改善微循環、抗血栓形成和擴張血管等作用^[5]。冰片為佐使藥，芳香走竄，“引藥上行”。

近年來，有關復方丹參方藥理藥效、藥代動力學、劑型、質量控制等研究報道較多。在藥代動力學領域，大多局限于丹參、三七單獨或聯合給藥后大鼠血漿藥動學行為研究，或注射單體后于某一時間點在大鼠腦組織中的分布情況研究^[6-9]。本研究采用UPLC-MS/MS技術，建立了復方丹參方中主要有效成分丹參酮Ⅱ_a、丹參酚酸B、人參皂苷Rg₁在大鼠血漿和腦組織中定量分析方法，并應用此分析方法對大鼠血漿及腦組織中的藥動學特征進行了研究，為進一步開展復方丹參方配伍規律、臨床應用研究奠定基礎。

1 材料

Waters Xevo TQ-S型三重四極桿液質聯用儀，包括Waters Acquity I 型 UPLC液相色譜儀帶自動進樣器和柱溫箱，帶電噴霧離子化源（ESI）和MassLynx V4.1軟件數據處理系統（Waters，美國）；METTLER TOLEDO MS105DU型1/10萬天平（METTLER，美國）；VORTEX-6旋渦混合器（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；VIBRAX VXR 振蕩器（德國IKA公司）；Eppendorf Centrifuge 5415型冷凍高速離心機（德國）；吉爾森移液器；ND100-1 氮氣吹掃儀（杭州瑞誠儀器有限公司）。

丹參酮Ⅱ_a（TSⅡ_a，純度99.08%，批號Must-15081916）、丹酚酸B（SAB，純度99.08%，批號Must-15092512）、人參皂苷Rg₁（GRg₁，純度98.10%，批號Must-15042215）對照品購自成都曼斯特生物科技有限公司；多潘立酮對照品（批號100304-201103）和雙氯酚酸鈉對照品（批號100334-200302）購自中國食品藥品檢定研究院；三七總皂苷（批號Must-15060601，人參皂苷Rg₁的質量分數為44.8%）；冰片（湖南科瑞鴻泰股份有限公司）和丹參（湖南崇善堂中藥飲片有限公司）經中南大學藥學院李勁平副教授鑒定均符合藥典規定；丹參煎液的制備：取丹參飲片300 g，按2015年版《中國藥典》中復方丹參片中丹參的提取工藝進行提取，并濃縮至200 mL。用HPLC測定丹參煎液中TSⅡ_a 6 g·L^-1，SAB 30 g·L^-1。甲醇、乙腈（色譜純，Merck）；甲酸（色譜純，ACS）；水（娃哈哈純凈水）；其他為分析純試劑。

SPF級SD雄性大鼠66只，體重（220±20） g，由中南大學湘雅三醫院動物實驗中心提供，合格證號SCXK（湘）2014-0016。

2 方法

2.1 給藥與樣品采集

大鼠適應性喂養1周后，實驗前12 h 禁食不禁水，并隨機分為11組，每組6只，各組大鼠均按丹參15 g·kg^-1（TSⅡ_a 60 mg·kg^-1，SAB 300 mg·kg^-1），三七5 g·kg^-1（GRg1 150 mg·kg^-1），冰片300 mg·kg^-1ig給藥。于給藥前和給藥后15，30，45 min 和1，1.5，2，4，6，8，10 h 摘除眼球采血，肝素抗凝。并立即在冰臺上快速取大鼠腦組織，剝離軟腦膜，生理鹽水洗凈，濾紙吸干表面水分，稱重，以生理鹽水為勻漿液，按1 mL生理鹽水含0.45 g腦組織進行勻漿，將血漿以及腦組織勻漿樣品均放置于-20 ℃冰箱保存。

2.2 樣品處理

2.2.1 血漿中TSⅡ_a，GRg₁測定樣品處理 精密吸取100 μL血漿，精密加入15 μL 多潘立酮（20 μg·L^-1）混勻，加入300 μL乙腈，于震蕩器上震蕩10 min（1 500 r·min^-1），13 200 r·min^-1離心8 min，吸取上清液100 μL置于新EP管中，加入200 μL水，渦旋混勻，取10 μL進樣檢測。

2.2.2 腦組織TSⅡ_a，GRg₁測定樣品處理 精密吸取100 μL腦組織勻漿，精密加入5 μL 多潘立酮溶液（20 μg·L^-1）混勻，加入150 μL乙腈，于震蕩器上震蕩10 min（1 500 r·min^-1），13 200 r·min^-1離心8 min，吸取上清液100 μL置于新EP管中，加入150 μL水，渦旋混勻，取10 μL進樣檢測。

2.2.3 血漿及腦組織中SAB測定樣品處理 精密吸取200 μL血漿或腦組織勻漿，精密加入10 μL雙氯芬酸鈉溶液（1 mg·L^-1）混勻，加入80 μL HCl溶液（1 mol·mL^-1）混勻，再以2 mL乙酸乙酯震蕩（1 500 r·min^-1）提取10 min，吸取上清，于40 ℃下N₂吹干，150 μL 50%乙腈溶液復溶，13 200 r·min^-1離心8 min，取上清10 μL進樣檢測。

2.3 測定條件

2.3.1 色譜條件 分別建立測定血漿與腦組織樣品中TSⅡ_a，GRg₁，SAB濃度的色譜條件。色譜柱ACQUITY UPLCTM BEH 苯基柱（2.1 mm× 50 mm，1.7 μm），流動相A為乙腈（含0.1%甲酸），B為0.25%甲酸水，柱溫為35 ℃，進樣體積10 μL。TSⅡ_a，GRg₁和內標多潘立酮的梯度洗脫程序為0～3 min，24% A，3～4 min，24%～85% A，4～6 min，85%A，6～7 min，24% A，流速0.2 mL·min^-1。SAB和內標雙氯芬酸鈉梯度洗脫程序為0～1.8 min，35%A，1.8～4 min，35%～60%A，4～5 min，60%～35%A，流速為0.25 mL·min^-1。

2.3.2 質譜條件 電噴霧離子源（ESI），分別以正、負離子模式檢測。正離子模式檢測TSⅡ_a，GRg₁和多潘立酮，負離子模式檢測SAB和雙氯芬酸鈉。工作參數設置為：離子源溫度500 ℃，噴霧電壓3.0 kV，霧化氣N₂的流速為1 000 L·h^-1，碰撞氣氬氣的流速為0.12 mL·min^-1。掃描方式為多反應檢測（MRM），檢測以下離子反應m/z 295/249.3（TSⅡ_a），碰撞能量為20 V；m/z 823.09/643.17（GRg₁），碰撞能量為35 V；m/z 426.20/147.0（多潘立酮），碰撞能量為35 V；m/z 716.81/518.83（SAB），碰撞能量為14 V；m/z 293.95/249.85（雙氯芬酸鈉），碰撞能量為10 V。

3 結果

3.1 專屬性考察

取大鼠空白血漿或腦勻漿、大鼠空白血漿或腦勻漿加對照品和內標、給藥后的大鼠血漿或腦勻漿（加內標），按2.2項下操作，色譜圖見圖1，結果表明，血漿和腦組織中內源性雜質不干擾待測物和內標的測定，方法專屬性良好。

3.2 線性范圍及定量下限考察

取對照品儲備液、大鼠空白血漿以及空白腦勻漿，通過倍比稀釋得到標準血樣和腦組織勻漿樣品，按2.2項下樣品前處理后進行分析，以被測化合物的峰面積（Y）對其在血漿或腦勻漿中的濃度（C）用加權（1/C²） 最小二乘法進行回歸運算，所得TSⅡ_a，SAB，GRg₁在大鼠血漿及腦勻漿中的標準曲線方程、線性范圍、相關系數以及定量下限見表1。試驗以S/N≥10作為定量標準。

3.3 精密度及準確度試驗

取空白血漿和空白腦勻漿90 μL或180 μL，分別加入不同濃度的TSⅡ_a，SAB，GRg₁對照品溶液10 μL或20 μL制備低、中、高質量濃度（TSⅡ_a血漿質量濃度為10，80，800 μg·L^-1；SAB血漿質量濃度為10，32，320 μg·L^-1；GRg₁血漿質量濃度為2，16，160 μg·L^-1；TSⅡ_a腦勻漿質量濃度為0.1，0.8，8 μg·L^-1；SAB腦勻漿質量濃度為10，32，320 μg·L^-1；GRg₁腦勻漿質量濃度為2，16，160 μg·L^-1）的QC樣品，按2.2項下方法處理，每個濃度點5個樣品，依法與標準曲線同批測定，連續測定3批（分別于3 d內完成），用隨行標準曲線計算QC樣品的濃度。據此求算方法的準確度和精密度。結果表明，血漿中TSⅡ_a日內、日間準確度分別為91.60%～93.14%（RSD≤4.1%，N=5），89.74%～91.48%（RSD≤5.8%，N=15）；腦勻漿中TSⅡ_a日內、日間準確度分別為95.20%～104.2%（RSD≤3.8%，N=5），102.7%～106.2%（RSD≤6.6%，N=15）；血漿中SAB日內、日間準確度分別為99.17%～110.5%（RSD≤6.3%，N=5），102.5%～106.2%（RSD≤7.3%，N=15）；腦勻漿中SAB日內、日間準確度分別為105.8%～106.5%（RSD≤3.4%，N=5），101.2%～105.2%（RSD≤8.0%，N=15）；血漿中GRg₁日內、日間準確度分別為101.9%～111.2%（RSD≤4.0%，N=5），96.37%～105.6%（RSD≤8.8%，N=15）；腦勻漿中GRg₁日內、日間準確度分別為87.42%～96.86%（RSD≤3.7%，N=5），90.31%～96.44%（RSD≤5.0%，N=15）。結果均符合生物樣品分析方法指導原則的要求。

3.4 回收率考察

準確配制血漿或腦勻漿的低、高濃度質控（QC）樣品，按2.2項下方法操作，記錄待測物和內標的峰面積；同時用空白基質配制相應濃度的待測物和內標溶液進樣得到的峰面積作為對照，每個濃度平行操作6份，回收率=血漿或腦勻漿樣品的平均峰面積/空白基質樣品平均峰面積×100%，結果用±s表示，見表2。采用同樣的方法考察內標多潘立酮和雙氯芬酸鈉在血漿和腦勻漿中的回收率，結果多潘立酮在血漿及腦勻漿中的回收率分別為（98.1±2.97）%，（100.0±1.31）%；雙氯芬酸鈉在血漿及腦勻漿中的回收率分別為（69.8±1.85）%，（77.5±3.85）%。

3.5 基質效應

取空白血漿或空白腦組織勻漿和相對應體積的純水，按2.2項下方法處理后，加入相應濃度的標準溶液，使得各待測組分的濃度與低、高質控樣品濃度相當，每個濃度重復6次，記錄空白生物基質峰面積A₁和水作為基質的峰面積A₂，基質效應=A₁/A₂×100%，結果用±s表示，見表2。內標多潘立酮在血漿及腦勻漿中的基質效應分別為（102.2±1.59）%，（83.4±0.520）%；內標雙氯芬酸鈉在血漿及腦勻漿中的基質效應分別為（176.4±2.760）%，（100.3±1.930）%。

3.6 穩定性試驗

取空白血漿和空白腦勻漿80 μL或180 μL，分別加入不同濃度的TSⅡ_a，SAB，GRg₁對照品溶液制備低、高濃度的QC樣品，并置于以下4種條件下考察其穩定性： ①QC 樣品于室溫放置6 h后處理進樣，結果顯示在血漿及腦勻漿中各藥物的準確度為-12.5%～6.34%；②將QC樣本反復凍融3次后處理進樣，結果顯示各藥物的準確度為-5.80%～13.9%；③將QC樣品按2.2項下方法處理后，置于4 ℃放置24 h后進樣，結果顯示各藥物的準確度為-12.5%～8.23%；④QC樣本置于-20 ℃下儲存2周后，處理進樣，各藥物的準確度為-7.72%～8.65%。每個濃度點平行制備3份。結果表明血漿樣本和腦勻漿樣本在上述的4種處理條件下均穩定。

3.7 稀釋方法學試驗

配制高于定量上限的TSⅡ_a，SAB，GRg₁大鼠血漿樣本，分別測定稀釋8倍、3倍、8倍后的樣品，用實測值乘以稀釋倍數后，計算濃度是否為標示值的85%～115%。結果顯示TSⅡ_a稀釋8倍、SAB稀釋3倍、GRg₁稀釋8倍不會影響測定的準確度。

3.8 血漿及腦組織藥動學研究

所取血漿樣本和腦勻漿樣本分別按2.2項下方法處理，按2.3.1項下條件測定，記錄各檢測成分和內標的峰面積，代入回歸方程，計算大鼠給藥不同時相TSⅡ_a，SAB，GRg₁的血藥濃度和腦組織濃度。所得數據用Phoenix WinNolin 6.1藥動學程序軟件進行非房室模型擬合，采用統計矩法計算藥動學參數。各被測成分平均血藥濃度-時間曲線、平均腦組織藥物濃度-時間曲線見圖2，主要藥動學參數見表3。

4 討論

4.1 檢測方法的確定

由于TSⅡ_a，SAB，GRg₁的極性、色譜行為等差別很大，SAB結構中有7個酚羥基和2個羧基，流動相的pH直接影響到峰形及響應，本實驗考察了不同流動相體系、流動相pH調節劑及色譜柱種類對三者保留時間、峰形、響應的影響，以同時達到峰形對稱、分析時間短、響應高的目的。本研究發現以乙腈（0.1%甲酸）-0.25%甲酸水為流動相，在ACQUITY UPLCTM BEH 苯基柱上分析時間較短（7 min），響應較高和峰形對稱。

本實驗嘗試使用正負離子同時檢測以及正負離子模式分時間段檢測TSⅡ_a，SAB，GRg₁，但效果不理想，即降低了3種被測物質的響應，其中以SAB最為明顯，達不到本研究的測定要求，故只能2種模式分開測定。本實驗在優選各被測物質及內標的離子對時，發現TSⅡ_a的離子對m/z 295/277.1比m/z 295/249.30響應更高，但是離子對m/z 295/277.1在空白血漿中干擾很大，且選擇離子對m/z 295/249.30仍能滿足本實驗定量下限的測定要求，故選擇離子對m/z 295/249.30對TSⅡ_a進行檢測。同時，本研究在內標化合物選取上也進行了大量的摸索，先后試用了地西泮、多潘立酮、泮托拉唑作為正離子模式內標，以其穩定性、色譜行為、質譜響應及回收率為指標，綜合評價后確定以多潘立酮作為檢測TSⅡ_a和GRg₁的內標物質；在選擇內標物時，本研究曾嘗試文獻[8]中使用過的氯霉素作為負離子模式下的內標物質，但由于空白血漿中干擾很大，所以選擇峰型對稱、穩定，與SAB有相似萃取行為的雙氯芬酸鈉作為內標。

4.2 提取方法的確定

本實驗曾嘗試使用沉淀法一步進行樣品前處理，該法雖簡單但同時也稀釋了待測樣品，導致待測物質SAB定量下限不能滿足本實驗的測定要求，因此改用液-液萃取法對SAB進行提取。本研究考察了不同提取溶劑，酸化試劑種類、濃度、體積對SAB提取率的影響，發現不同的提取溶劑對SAB的提取率影響較大，乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯-乙醚等有機溶劑提取回收率均低于乙酸乙酯，酸化試劑的種類、濃度及體積對SAB提取回收率影響較大，10%三氯乙酸、10%HCl溶液及其他體積1 mol· mL^-1HCl 溶液對SAB的提取率均低于1 mol· mL^-1HCl 溶液。同時也考察了1.5，2，3 mL乙酸乙酯對SAB萃取率的影響，2 mL與3 mL并無明顯區別，均比1.5 mL 乙酸乙酯提取效率高，所以本實驗樣品處理時先用80 μL 1 mol· mL^-1鹽酸酸化血漿樣品，然后用2 mL乙酸乙酯直接提取血漿樣品，SAB的提取回收率可達70%以上。本實驗與文獻[10-11]比較，極大地減少了有機溶劑乙酸乙酯的使用，得到了較好的提取回收率。

4.3 血漿及腦組織藥動學結果分析

從圖2中可知，給藥后15 min，大鼠血漿及腦組織中均能測到TSⅡ_a，SAB，GRg₁，說明三者吸收速率和腦分布速率都很快，對腦缺血或腦缺血再灌注損傷等急性腦部疾病能起到速效的作用。TSⅡ_a和GRg₁在給藥后10 h仍能在大鼠血漿及腦組織中檢測到，但SAB于給藥后8，1.5 h，分別在血漿及腦組織中清除完全。從表3中可知，TSⅡ_a在血漿中的AUC0-t均大于SAB 和GRg₁，而TSⅡ_a的給藥劑量（60 mg·kg^-1）均小于SAB（300 mg·kg^-1）和GRg₁（150 mg·kg^-1），提示TSⅡ_a的口服吸收較SAB，GRg₁更充分，可能是由于SAB與GRg₁為親水物質，很難透過小腸壁的脂質雙分子層而造成口服生物利用度低下。從表3中可知，GRg₁的腦選擇性指數（0.43±0.24）高于TSⅡ_a和SAB（分別為0.001 8±0.002 1，0.031±0.013），可能是由于GRg₁與血紅蛋白結合率較低，使其較易透過血腦屏障。有研究表明，單獨靜注單體SAB，口服丹參或者靜注SAB，TSⅡ_a與三七總皂苷提取物后，腦內無法檢測到SAB^{[8，12-13]}，而本研究于給藥后15，30，60，90 min內均檢測到SAB，可能是本研究用UPLC-MS/MS檢測SAB有更低的檢出限和更高的靈敏度，或者復方丹參方中復雜的成分以及芳香藥冰片有開放血腦屏障的作用所致，同時也提示中醫藥復方配伍對方中有效成分藥代動力學行為有顯著影響，這也是中醫藥復方配伍優勢所在，但仍需進一步研究考證。

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[責任編輯 曹陽陽]