以花生餅制花生醬的雙菌種制曲工藝研究

張玲，梁妍，陳善美，張鐘

(廣東石油化工學院 環境與生物工程學院，廣東 茂名 525000)

以花生餅制花生醬的雙菌種制曲工藝研究

張玲*，梁妍，陳善美，張鐘

(廣東石油化工學院 環境與生物工程學院，廣東 茂名 525000)

以花生高溫榨油產生的下腳料花生餅為原料，分別接種黑曲霉及米曲霉制備花生醬成曲。以成曲的糖化酶活力和氨基態氮含量為依據，考察了花生餅用量、制曲時間及孢子接種量對成曲制備效果的影響，并通過正交試驗優化了兩種霉菌制曲的最佳工藝條件。結果表明：米曲霉單獨制曲的最佳條件為制曲時間44 h、接種孢子數4.40×108個/g、花生餅用量比例為80%，此條件下得到的成曲糖化酶活力為905 U/g，氨基態氮含量為0.434 g/dL；黑曲霉單獨制曲的最佳條件為制曲時間26 h、接種孢子數8.03×109個/g、花生餅比例90%，此條件下得到的成曲糖化酶活力為926 U/g，氨基態氮含量為0.450 g/dL。研究結果為后續深入研究以高溫花生餅制備花生醬奠定了基礎。

花生餅；米曲霉；黑曲霉；制曲

花生醬含有豐富的蛋白質、維生素和礦物質等，其營養豐富、風味獨特，是很好的佐餐和調味品[1]。目前我國對花生醬的重視程度不斷提高，花生醬已占我國食用花生消費的37%[2]。隨著人們生活水平的不斷提高，醬類等調味品的市場需求方向逐漸趨向多樣化、復合方便化、高檔化和營養保健化[3,4]?；ㄉu由于營養價值極高，已被證實可以用作治療營養不良的治療性食品[5,6]。

花生餅是花生高溫榨油后的副產物，含有近50%左右的粗蛋白質[7]。而高溫榨油導致這些蛋白質變性嚴重，營養效價變低，使得花生餅的傳統利用形式主要作為肥料或者飼料，這在很大程度上造成了資源的嚴重浪費。本文嘗試利用花生餅發酵制花生醬，具有明顯的經濟和社會價值。

發酵法制備醬類調味品，前期需要制備合適的成曲。目前，相關研究較多，如張夢茹等[8]利用豆渣代替豆粕生產醬產品；周顯青等[9]以碎米為原料，接種黑曲霉后制曲，采用響應面法優化米醬的制曲工藝。付雯等[10]研究不同條件對黑曲霉、根霉混合制曲效果的影響，確定黑曲霉、根霉混合制曲的最適條件。本文以花生餅為原料，采用米曲霉及黑曲霉為菌種的雙菌種制曲工藝，依次進行斜面培養、種曲培養和成曲培養，比較制曲時間、接種孢子量、花生餅添加比例對成曲糖化酶活力和氨基態氮的影響，并在單因素試驗基礎上進行正交試驗，確定了最優工藝參數，為花生餅制花生醬的生產提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 原料

花生餅：由茂名嘉嘜食品有限公司提供；面粉、麩皮：均為市售。

1.1.2 菌種

米曲霉：中科3.951(即滬釀3.042)米曲霉；黑曲霉：黑曲霉AS3.350；以上菌種均由春豐食用菌合作社提供。

1.1.3 主要設備

HH-S24型數顯恒溫水浴鍋 深圳市三利化學有限公司；AUY 220型分析天平 日本島津公司；HX-5022型電子天平 上海天平儀器廠；HPX-9162MBE型恒溫培養箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；XB.K.25型血球計數板 上海市求精生化試劑儀器有限公司；XFS-280A型高壓滅菌鍋 浙江新豐醫療器械有限公司；PHS-3C型臺式pH計 上海雷磁儀電科學儀器股份有限公司；HW-23型恒溫磁力攪拌器、80-2型電動離心機 常州澳華儀器有限公司；85-2型顯微鏡 江蘇省金壇市精達儀器制造廠；XSP-02-640X型電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司； RE-52A型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D(Ⅲ)型循環水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠；722N型可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；C21-SK2105型電磁爐 廣東美的生活電器制造有限公司。

1.1.4 主要試劑

百里酚酞 上海源葉生物科技有限公司；氫氧化鈉 北京華宇永盛科技有限公司；甲醛 河北勝利建材化工有限公司；中性紅 梯希愛(上海)化成工業發展有限公司；無水乙醇 禹城市創新化工有限公司；硫酸 天津市進豐化工有限公司；葡萄糖、乙酸鈉 吳江市天翔化工有限公司；瓊脂 河南三佳化工有限公司；硫酸銅 山西金順達化工有限公司；次甲基藍、碳酸鈉、冰醋酸、硫代硫酸鈉 天津市大茂化學試劑廠；酒石酸鉀鈉 洛陽市化學試劑廠；亞鐵氰化鉀 天津市福晨化學試劑廠；碘、碘化鉀 天津市光復科技發展有限公司；硫酸、可溶性淀粉、乙酸鋅 廣東汕頭新寧化工廠；以上試劑均為分析純。

1.2 培養基

1.2.1 米曲霉及黑曲霉斜面培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)。

1.2.2 米曲霉及黑曲霉三角瓶擴大培養基

麩皮80 g、面粉20 g、水80～90 mL。將原料混勻后，分裝于已經滅菌的250 mL三角瓶或玻璃罐頭內，料厚度1 cm左右，121 ℃濕熱滅菌30 min，滅菌后趁熱把曲料搖散。

1.2.3 米曲霉及黑曲霉種曲培養基

麩皮8 g、花生餅4 g、水8 mL，混勻于250 mL三角瓶中，高溫高壓(121 ℃，0.1 MPa)滅菌20 min[11]。

1.2.4 米曲霉及黑曲霉成曲培養基

稱取花生餅80 g，浸泡5 h，高溫高壓(121 ℃，0.1 MPa)蒸煮8 min，取出，待溫度降至40 ℃，加入20 g已干蒸過的面粉拌勻[12]。

1.3 工藝流程

花生餅→去雜→粉碎→加水潤水→蒸料→冷卻→斜面培養→三角瓶擴大培養→種曲培養→測孢子數→成曲培養→氨基態氮含量測定→糖化酶活力測定。

1.4 操作工藝要點

1.4.1 粉碎

花生餅塊大堅硬，需進行粉碎，以利于潤水、蒸煮，加大曲霉菌絲生長總面積，增加酶的分泌量[13]。

1.4.2 加水、潤水與加水量

向原料中加入適量的水分，原料均勻而完全吸收水分的過程稱為潤水，加水、潤水的目的是：使原料中蛋白質含有一定的水分，以便于蒸煮時迅速適度變性；使原料中淀粉易于充分糊化，以便溶出曲霉生長所需的碳素營養成分，提供曲霉生長繁殖所必要的水分。

加水量的多少直接關系到成曲的質量。適當的加水量有利于蒸煮，使原料蛋白質變性和曲霉生長繁殖，水分過多或過少，都不利于米曲霉的生長繁殖和酶的分泌，對醬的質量產生不良影響。

生產實踐表明：加水量以花生餅計，在80%～100%較合適，蒸熟后曲料含水量為48%～50%[14]。

1.4.3 蒸料

蒸料是為了使原料中的蛋白質完全適度地變性，即成為酶容易作用的狀態，使原料中的淀粉糊化成為可溶性淀粉，供曲霉利用，并通過蒸煮消滅附著在原料上的微生物，提高制曲的安全性。因此，要掌握適當的蒸煮壓力(溫度)和時間，才能使原料蛋白質完全適度地變性，提高原料蛋白質利用率和醬的質量。

1.4.4 斜面菌種培養

斜面培養基接種后，于30 ℃恒溫培養3天。

1.4.5 三角瓶擴大培養

待培養基曲料冷卻至室溫，無菌操作接入斜面孢子1～2環，充分搖勻后，將培養基堆積在瓶底一角，于30 ℃培養。18～20 h后，見白斑及菌絲生長，把培養基充分搖碎并平攤于瓶底。繼續培養約6 h，菌絲大量生長又結成餅狀，進行第2次搖瓶，把小團塊亦充分搖松，仍平攤于瓶底培養。約經48 h，菌絲充分生長，形成結餅狀即可扣瓶(將三角瓶斜倒，使底部曲料翻轉，以充分接觸空氣)?？燮亢?，將瓶橫放繼續培養至孢子充分長滿曲料，共需3天。培養好的三角瓶曲應及時使用，如果短時間保存，需置于4 ℃冰箱中，時間不宜超過10天。

1.4.6 種曲培養

先把三角瓶種曲與少量滅過菌的干麩皮拌和均勻后，撒在熟料上，均勻接種。厚度6～7 mm，稍予攤平，中間亦少。置于恒溫培養箱中，30 ℃培養72 h。

種曲制成后，移出放置于陰涼通風處干燥保存，應及時使用。

1.4.7 孢子懸浮液的制備

精確稱取種曲1 g(精確至0.002 g)，倒入盛有玻璃珠的250 mL三角瓶內，加入95%酒精5 mL、無菌水20 mL、稀硫酸10 mL，充分振搖，使種曲分散，然后用3層紗布過濾，用無菌水反復沖洗，務使濾渣不含孢子，最后稀釋至500 mL[15]。

1.4.8 孢子數的測定

采用血球計數器測定。

1.4.9 成曲培養

從種曲中接種定量孢子數到成曲培養基，放于30 ℃、濕度80%的恒溫恒濕箱中培養。

1.5 氨基態氮含量測定

氨基酸態氮是豆醬發酵過程中的主要指標，其數值越高，表明菌種對蛋白質的分解能力越強，成品滋味越鮮美。由于黑曲霉孢子為棕黑色，制作酶液時顏色較深，不利于顯色判定終點；而甲醛又有一定的毒性，所以以雙指示劑甲醛滴定法測定米曲霉制曲時的氨基態氮含量，以電位滴定法測定黑曲霉制曲時的氨基態氮含量。

1.5.1 米曲霉制曲時的氨基態氮含量測定

采用雙指示劑甲醛滴定法進行測定。移取一定量(約含20 mg的氨基酸)樣品溶液2份，分別置于250 mL錐形瓶中，加水50 mL；其中一份加3滴中性紅指示劑，用0.10 mol/L NaOH溶液滴定至琥珀色為終點；另一份加入中性甲醛10 mL及3滴百里酚酞指示劑，搖勻，靜置1 min(此時藍色應消失)。再用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至淡藍色。記錄2次滴定所消耗的堿液毫升數，按下式計算：

式中：N為NaOH標準溶液當量濃度，mol/L；V1為測定樣品消耗NaOH標準溶液的體積，mL；V2為測定空白消耗NaOH標準溶液的體積，mL；W為樣品溶液相當樣品的質量，g；0.014為氮的毫克當量。

測定時樣品的顏色較深，應加活性炭脫色之后再滴定[16]。

1.5.2 黑曲霉制曲時的氨基態氮含量測定

采用電位滴定法進行測定。吸取樣液5.0 mL，加水定容至100 mL。于200 mL燒杯中吸取20.0 mL試樣，加60 mL蒸餾水，開啟磁力攪拌器，待攪拌穩定后把酸度計的復合電極小心放入燒杯，用氫氧化鈉標準溶液滴定至酸度計指示pH值為8.2，記下消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，計算總酸含量。

準確加入10.00 mL甲醛溶液，混勻，再用氫氧化鈉標準溶液繼續滴定至pH值為9.2，記錄消耗氫氧化鈉標準溶液的體積。同時量取80 mL蒸餾水，先用0.05 mol/L氫氧化鈉標準溶液調節至pH值為8.2，再加入10 mL甲醛溶液，用氫氧化鈉標準溶液滴定至pH值為9.2，作為試劑空白對照。

樣品中氨基態氮含量按下式計算，結果保留兩位有效數字。

式中：X為每百毫升樣品中氨基態氮的含量，g;V1為測定樣品在加入甲醛后滴定至終點(pH值為9.2)所消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，mL；V2為空白試驗加入甲醛后滴定至終點(pH值為9.2)所消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，mL；C為氫氧化鈉標準溶液的濃度，mol/L；0.014為與1.00 mL氫氧化鈉標準溶液相當的氮的質量，g[17]。

1.6 糖化酶活力的測定

糖化酶有催化淀粉水解的作用，能從淀粉分子非還原性末端開始，分解α-1,4葡萄糖苷鍵生成葡萄糖，葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸鈉氧化，過量的次碘酸鈉酸化后析出碘，再用硫代硫酸鈉標準溶液滴定，計算出酶活力。

1.6.1 操作步驟

1.6.1.1 待測酶液的制備

稱取成曲1～2 g，精確至0.0002 g(或吸取液體酶1.00 mL)，先用少量的乙酸緩沖液溶解，并用玻璃攪拌棒搗研，將上清液小心傾入容量瓶中。沉渣部分再加入少量緩沖液， 如此搗研3～4次，最后全部移入容量瓶中，用緩沖液定容至刻度搖勻，通過4層紗布過濾，濾液供測定用。

1.6.1.2 測定

于甲、乙2支50 mL比色管中，分別加入可溶性淀粉溶液25.0 mL及緩沖液5.00 mL，搖勻后，于(40±0.2 )℃恒溫水浴中預熱5 min。在甲管(樣品)中加入待測酶液2.00 mL， 立刻搖勻，在此溫度下準確反應30 min，立即各加氫氧化鈉溶液0.2 mL，搖勻，將2管取出迅速冷卻，并于乙管(空白)中補加待測酶液2.00 mL。

吸取上述反應液與空白液5.00 mL，分別置于碘量瓶中，準確加入碘溶液10.0 mL，再加氫氧化鈉溶液15.0 mL，搖勻，密塞，于暗處反應15 min。取出，加硫酸溶液2.0 mL，立即用硫代硫酸鈉標準溶液滴定，直至藍色剛好消失為其終點。

1.6.2 計算

樣品的酶活力計算公式如下：

X=(A-B)c×90.05×32.2/5×1/2×n×2=579.9×(A-B)c×n。

式中：X為樣品的酶活力，U/g；A為空白消耗硫代硫酸鈉標準溶液的體積，mL；B為樣品消耗硫代硫酸鈉標準溶液的體積，mL；c為硫代硫酸鈉標準溶液的濃度，mol/L；n為稀釋倍數；90.05為與1.00 mL硫代硫酸鈉標準溶液相當的以克表示的葡萄糖的質量；32.2為反應液的總體積，mL；5為吸取反應液的體積，mL；1/2為吸取酶液2.00 mL，以1.00 mL計；2為反應30 min，換算成1 h的酶活力系數；所得的結果表示至整數。

1.7 單因素試驗

1.7.1 制曲時間的確定

稱取花生餅80 g，浸泡5 h，高溫高壓(121 ℃，0.1 MPa)蒸煮8 min，取出，待溫度降至40 ℃，加入20 g已干蒸過的面粉麩皮(比例為11∶1)拌勻，然后從種曲中接種4.40×107個/g孢子，放于30 ℃、濕度80%的恒溫恒濕箱中培養。每2 h定時取樣，測定樣品氨基態氮含量和糖化酶活力，確定制曲時間。

1.7.2 制曲接種孢子量的確定

稱取花生餅80 g，浸泡5 h，高溫高壓(121 ℃，0.1 MPa)蒸煮8 min，取出，待溫度降至40 ℃，加入20 g已干蒸過的面粉麩皮(比例為11∶1)拌勻，然后從種曲中接種不同數量的孢子，放于30 ℃、濕度80%的恒溫恒濕箱中培養，42 h后測定樣品氨基態氮含量，并根據氨基態氮含量的變化、糖化酶活力確定制曲接種孢子數。

米曲酶接種的孢子量依次是：4.40×105，4.40×106，4.40×107，4.40×108，4.40×109個/g，以接種孢子量的對數作圖。

黑曲酶接種的孢子量依次是：8.03×105，8.03×106，8.03×107，8.03×108，8.03×109個/g，以接種孢子量的對數作圖。

1.7.3 花生餅添加比例的確定

稱取花生餅60，70，80，90，100 g，浸泡5 h，高溫高壓(121 ℃，0.1 MPa)蒸煮8 min，取出，待溫度降至40 ℃，分別加入40，30，20，10，0 g已干蒸過的面粉麩皮(比例為11∶1)拌勻，然后從種曲中接種4.40×107個/g孢子，放于30 ℃、濕度80%的恒溫恒濕箱中培養，42 h后測定樣品氨基態氮含量，并根據氨基態氮含量的變化、糖化酶活力確定制曲面粉添加量[18]。

1.8 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，進行正交試驗，確定最優工藝參數。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 制曲時間對糖化酶活力和氨基態氮含量的影響

圖1 米曲酶制曲時間對糖化酶活力和氨基態氮含量的影響

圖2 黑曲霉制曲時間對糖化酶活力和氨基態氮含量的影響

由圖1和圖2可知，糖化酶活力和氨基態氮含量隨著曲酶制曲時間的延長而上升，米曲霉和黑曲霉分別在制曲時間42，26 h時，其糖化酶活力和氨基態氮含量達到最大值，之后酶活力稍微下降，這是因為制曲時間過短，霉菌不能充分生長，菌絲沒有完全深入到基質，導致原料未分解徹底，降低了原料利用率且成曲也未達到最高酶活；制曲時間過長，一方面，感染雜菌的幾率增加，且生產效率降低；另一方面，糖化酶活達到峰值后，米曲霉和黑曲霉的孢子已經過了生長、成熟的階段，處于生長后期，活性已不再那么強。

2.1.2 制曲接種孢子量對糖化酶活力和氨基態氮含量的影響

圖3 米曲霉制曲接種孢子量對數對糖化酶活力和氨基態氮含量的影響

圖4 黑曲霉制曲接種孢子數對數對糖化酶活力和氨基態氮含量的影響

由圖3和圖4可知，糖化酶活力和氨基態氮含量隨著接種量的增加而提高，達到一定的峰值后下降。米曲霉和黑曲霉制曲接種孢子數分別為7.64和9.90時，其糖化酶活力和氨基態氮含量達到最大值。初步確定米曲霉接種孢子數為7.64，黑曲霉接種孢子數為9.90，這是因為不同的接種量對米曲霉活性有很大的影響，接種量太大，培養基中的營養物質有限，不足以維持米曲霉的生長所需，將形成大量的休眠孢子，降低酶的活性，接種量太小，接入的生物量不足，培養基的營養過剩，容易造成浪費。

2.1.3 花生餅添加比例對糖化酶活力和氨基態氮含量的影響

圖5 米曲酶制曲花生餅添加比例對糖化酶活力和氨基態氮含量的影響

圖6 黑曲霉制曲花生餅添加比例對糖化酶活力和氨基態氮含量的影響

由圖5和圖6可知，糖化酶活力和氨基態氮含量隨著花生餅添加比例的增加而提高，達到一定的峰值后下降?；ㄉ炋砑颖壤_80%時，用黑曲霉和米曲霉制曲所得的曲的糖化酶活力和氨基態氮含量都達到最高值，這是因為麩皮質地疏松、體輕、表面積大，含有粗蛋白質、粗脂肪、粗纖維素，還有鈣、鐵等無機鹽，能促進曲霉生長和產酶，提高醬原料的利用率和出品率。如果面粉添加太少，僅依靠花生餅不可以提供全面的營養給菌種；如果面粉添加比例太多，面粉包裹餅料，不利于制曲。

2.2 制曲條件的優化

米曲霉制曲因素水平表見表1。

表1 米曲霉制曲因素水平表

黑曲霉制曲因素水平表見表2。

表3 米曲霉制曲正交試驗結果

由表3可知，以糖化酶活力為依據，米曲霉單獨制曲的最佳工藝為A2B2C3；以氨基態氮含量為依據，米曲霉單獨制曲的最佳工藝為A3B1C3或A2B2C3。同時以糖化酶活力和氨基態氮含量為依據，綜合考慮，可確定最佳工藝參數組合為A2B2C3，即試驗序號5，制曲時間44 h，制曲接種孢子數7.64，即4.40×108個/g ，花生餅比例80%，糖化酶活力為905 U/g，氨基態氮含量為0.434 g/dL。

表4 黑曲霉制曲正交試驗結果

由表4可知，以糖化酶活力為依據，黑曲霉單獨制曲的最佳工藝為A1B3C3或A2B3C3；以氨基態氮含量為依據，黑曲霉單獨制曲的最佳工藝為A2B3C2或A2B3C3；同時以糖化酶活力和氨基態氮含量為依據，綜合考慮，可確定最佳工藝參數組合為A2B3C3。

另用最佳生產工藝參數組合A2B3C3制曲，測得其糖化酶活力為926 U/g，氨基態氮含量為0.450 g/dL。比正交試驗各試驗號都高，確定最佳生產工藝參數組合為A2B3C3，制曲時間26 h，制曲接種孢子數9.90，即8.03×109個/g ，花生餅比例90%，糖化酶活力為926 U/g，氨基態氮含量為0.450 g/dL。

3 結論

以花生餅為制曲培養基，以糖化酶活力和氨基態氮含量為依據，對培養時間、孢子接種量、花生餅原料比例分別進行單因素試驗，確定單因素最佳值。再以單因素最佳值為參考，進行三因素三水平的正交試驗。

米曲霉單獨制曲的最佳工藝為：制曲時間44 h，制曲接種孢子數4.40×108個/g，花生餅比例80%，糖化酶活力為905 U/g，氨基態氮含量為0.434 g/dL；黑曲霉單獨制曲的最佳工藝為：制曲時間26 h，制曲接種孢子數8.03×109個/g ，花生餅比例90%，糖化酶活力為926 U/g，氨基態氮含量為0.450 g/dL。實驗結果表明：可以采用雙菌種制曲工藝將花生餅制成花生醬，此研究結果為發酵法生產花生醬提供了理論依據。

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Study on Koji-making Process of Peanut Butter Made from Peanut Cake with Double Strains

ZHANG Ling*, LIANG Yan, CHEN Shan-mei, ZHANG Zhong

(College of Environment and Biological Engineering, Guangdong University of Petrochemical Technology，Maoming 525000, China)

Use the peanut cake scraps produced by high temperature oil extraction as raw material,inoculateAspergillusnigerandAspergillusoryzaeto prepare finshed koji of peanut butter respectively. Use saccharifying enzyme activity and amino nitrogen content of finshed koji as basis to examine the effect of peanut cake dosage, koji making time and spore inoculation amount on preparation of finshed koji, and use orthogonal test to optimize the optimum process conditions of two kinds of strains. The results show that the best conditions ofAspergillusoryzaekoji making are time of 44 h, spore inoculation amount of 4.40×108per g, peanut cake dosage proportion of 80%, under such conditions, the saccharifying enzyme activity of finished koji is 905 U/g, amino nitrogen content is 0.434 g/dL; the best conditions ofAspergillusnigerkoji making are time of 26 h, spore inoculation amount of 8.03×109per g, peanut cake dosage proportion of 90%, under such conditions, the saccharifying enzyme activity of finished koil is 926 U/g, amino nitrogen content is 0.450 g/dL. The results have provided foundation for the following study of using high-temperature peanut cake to prepare peanut butter.

peanut butter;Aspergillusoryzae;Aspergillusniger; koji making

2016-12-18 *通訊作者

茂名市科技計劃項目(20140310)；廣東石油化工學院創新強校培育項目

張玲(1979-)，女，副教授，碩士，主要從事農產品加工與貯藏方面的教學與研究工作。

TS201.1

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.06.018

1000-9973(2017)06-0086-07