靈芝酸A對人炎性乳腺癌細胞體外增殖和凋亡的影響

林曉萌，丁琪瓊，陳鵲汀，張 磊，郝 鑫，，李 中

(1.河北大學附屬醫院乳腺外科，河北 保定071000；2. 北京協和醫院臨床與藥理中心，北京100032；3.河北大學附屬醫院腫瘤內科 河北省腫瘤放化療機制與規程研究重點實驗室，河北 保定071000)

炎性乳腺癌是一種惡性程度極高的局部晚期特殊類型的惡性腫瘤之一，約占所有乳腺癌的6%，發病率逐年上升。由于病因不清及病情迅猛，臨床治療方式主要采用手術切除輔助化療，但術后及預后效果仍較差，患者的平均生存期低于2.5年[1]?；熕幬锊涣挤磻^重，而且容易產生耐藥性，從而降低藥效，降低患者的生存期，甚至導致治療失敗。因此，尋找有效抑制炎性乳腺癌細胞增殖、生長的藥物成為治療的關鍵。靈芝酸A是從靈芝孢子粉中提取的主要成分，屬于靈芝三萜類化合物中的一種[2-3]。近年來研究[4-6]顯示：靈芝酸A具有抗腫瘤細胞增殖、抑制腫瘤細胞侵襲能力以及誘導人乳腺癌、肝癌、肺癌細胞凋亡的作用。體內外研究[7-8]表明：靈芝酸A可控制淋巴瘤生長，增強HepG2細胞對順鉑的化學敏感性，抑制癌細胞的生長和侵襲。迄今為止，國內外關于靈芝酸A對人炎性乳腺癌SUM149細胞的體外抑瘤作用鮮有報道。本文作者采用MTT法和流式細胞術等方法，研究靈芝酸A對體外人炎性乳腺癌SUM149細胞增殖和凋亡的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑人炎性乳腺癌SUM149細胞由北京大學醫學部病理教研室提供。靈芝酸A購于大連美侖生物技術有限公司。胰蛋白酶購自北京鼎國生物技術有限公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，DMED培養基和二甲亞砜購自美國Sigma 公司，2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)購自北京百奧生物公司

1.2 細胞培養人炎性乳腺癌SUM149細胞37℃水浴復蘇，置于含10%胎牛血清、100 U·mL-1鏈霉素和100 U·mL-1青霉素的DMEM F12培養液中，于37℃、5%CO2的飽和濕度恒溫培養箱中培養，定期觀察細胞形態，細胞融合度達80%～90%時，加入0.25%胰蛋白酶對貼壁的SUM149細胞進行消化，取對數生長期細胞用于實驗。

1.3 MTT法檢測細胞增殖抑制率取對數生長期SUM149細胞消化后制成單細胞懸液，稀釋成1×104mL-1，每孔200 μL加入96孔板中。當細胞貼壁生長24 h后，加入含不同濃度靈芝酸A [0(對照組)、0.1、0.5、1.0、5.0和10.0 μmol·L-1]的培養基(每樣設 4 個復孔)，置于恒溫培養箱中培養24、48和72 h后，再加入MTT溶液，20 μL/孔，37℃再培養4 h。棄去培養上清液，每孔再加入150 μL二甲基亞砜，振蕩10 min，溶解混勻。利用酶聯免疫檢測儀，于490 nm波長處測定吸光度(A)值，取平均值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(對照組A值-實驗組A值)/ 對照組A值×100%。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率和細胞周期百分率取對數生長期SUM149細胞制成單細胞懸液，稀釋成1×105mL-1接種于培養瓶內，置于培養箱中培養，生長24 h后加入含不同濃度靈芝酸A[0(對照組)、0.1、0.5、1.0、5.0和10.0 μmol·L-1]的培養基，培養24、48和72 h后，加入0.25%胰蛋白酶消化，1 500 r·min-1離心5 min，棄上清液，用PBS沖洗2次，加入1 mL預冷70%乙醇中，-20℃保存固定24 h。PBS沖洗2次，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，加入的PBS重懸細胞。樣品上機染色，分別加入0.5 mL碘化丙啶染色液，細胞充分重懸，避光4℃染色30 min。利用流式細胞儀，于波長488 nm處測定紅色熒光。利用以下公式計算分析各組細胞凋亡率。利用ModFit分析軟件分析細胞DNA含量，檢測對照組和5、10.0 μmol·L-1靈芝酸A組不同周期細胞百分率。細胞凋亡率=凋亡細胞數/(凋亡細胞數+正常細胞數)×100%。

1.5 免疫細胞化學染色法檢測各組細胞中Ki67和Livin蛋白表達水平取對數生長期SUM149細胞消化后制成單細胞懸液，稀釋成1×105mL-1，取6孔板，每孔加入1.8 mL細胞懸液，置于恒溫培養箱中培養12 h，加入含不同濃度的靈芝酸A [0(對照組)、0.1、0.5、1.0、5.0和10.0 μmol·L-1]的培養基，置于恒溫培養箱中培養24、48和72 h后，棄去上層培養基，PBS沖洗，加入4%多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗，加入1 mL 0.1%Trionx-100室溫反應30 min，PBS沖洗，加入3%過氧化氫孵育10 min，PBS沖洗，加入一抗(1∶50兔抗 Livin 單克隆抗體，1∶100兔抗 Ki67 單克隆抗體)，4℃孵育12 h，加入二抗生物素化羊抗，37℃孵育 1 h，DAB 顯色，蘇木精溶液中復染1 min，酒精脫水，二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中透明，封片，顯微鏡下觀察，利用Image Pro Plus 6.0 軟件分析 Ki67和Livin蛋白陽性表達的累積吸光度(A)值，代表蛋白表達水平。

2 結 果

2.1 各組SUM149細胞增殖抑制率隨著靈芝酸A濃度的增加和作用時間的延長，SUM149細胞增殖抑制率呈明顯上升趨勢。作用24、48和72 h時，與0.1 μmol·L-1靈芝酸A組比較，0.5、1.0、5.0和10.0 μmol·L-1靈芝酸A組SUM149細胞增殖抑制率明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。相同靈芝酸A濃度，隨著干預時間(24、48和72 h)的延長，SUM149細胞的增殖抑制率逐漸升高，72 h與24 h時組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 各組SUM149細胞凋亡率相同作用時間，與對照組比較，不同濃度靈芝酸A組細胞凋亡率明顯升高(P<0.05或P<0.01)。相同靈芝酸A濃度，不同作用時間(24、48和72 h)組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。隨著靈芝酸A作用濃度的升高和作用時間的延長，SUM149細胞凋亡率逐漸升高，呈濃度和時間依賴性。見表2。

表1 各組SUM149細胞增殖抑制率

Tab.1 Inhibitory rates of proliferation of SUM149 cells in various groups

表1 各組SUM149細胞增殖抑制率

GroupInhibitoryrate(t/h) 244872Control000GanodermalucidumA(μmol·L-1) 0．112．09±2．1129．57±5．5835．58±6．28△ 0．521．33±5．27?35．49±8．51?41．28±7．73?△ 1．030．67±6．18?45．25±9．04?49．19±9．94?△ 5．039．78±7．11?49．77±8．76?55．10±11．90?△ 10．050．48±9．64??58．03±10．29??61．54±13．02??△

*P<0.05,**P<0.01 compared with 0.1 μmol·L-1ganoderma lucidum A group;△P<0.05 compared with 24 h.

表2 各組SUM149細胞凋亡率

Tab.2 Apoptotic rates of SUM149 cells in various groups

表2 各組SUM149細胞凋亡率

GroupInhibitoryrate(t/h) 244872Control0．71±0．170．84±0．191．16±0．15GanodermalucidumA(μmol·L-1) 0．11．15±0．262．12±0．33?7．95±1．10?△ 0．51．81±0．523．17±0．48??12．74±2．81??△ 1．02．20±0．66?5．23±0．52??19．47±3．30??△ 5．02．71±0．84?9．40±1．38??22．47±5．71??△ 10．04．92±0．89??11．66±2．21??28．17±5．89??△

*P<0.05 ，**P<0.01 compared with control group；△P<0.05 compared with 24 h.

2.3 各組SUM149細胞不同周期細胞百分率與對照組比較，不同濃度靈芝酸A組SUM149細胞中G1期細胞百分率明顯增加(P<0.05)，且隨著靈芝酸A 作用時間的延長G1期細胞百分率也明顯增加。與對照組比較，不同濃度靈芝酸A組SUM149細胞中S期細胞百分率明顯減少(P<0.05或P<0.01)，且隨著靈芝酸A作用時間的延長S期細胞百分率也明顯減少。與對照組比較，不同濃度靈芝酸A組SUM149細胞中G2期細胞百分率差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組SUM149細胞不同周期細胞百分率

Tab.3 Percentages of SUM149 cells at different phases in various groups

表3 各組SUM149細胞不同周期細胞百分率

GroupG1(t/h) 244872S244872Control53．3±7．160．5±8．659．1±5．830．9±4．317．5±1．127．9±4．7GanodermalucidumA(μmol·L-1) 5．057．9±8．366．1±9．284．5±8．1?26．8±3．82．2±0．3??3．6±0．7?? 10．062．0±6．6?78．5±6．3?85．2±7．6?22．1±3．1?2．6±0．5??3．4±0．4??GroupG2(t/h) 244872Control13．9±1．424．3±2．113．1±1．7GanodermalucidumA(μmol·L-1) 5．011．3±1．136．0±2．017．3±1．4 10．018．1±1．322．8±2．716．6±1．8

*P<0.05 ，**P<0.01 compared with control group.

2.4 各組SUM149細胞中Ki67和Livin蛋白表達水平Ki67蛋白陽性表達位于細胞核，Livin蛋白陽性表達位于細胞漿。相同靈芝酸A濃度，隨著作用時間的延長，Ki67和Livin蛋白表達水平明顯降低；相同作用時間，隨著靈芝酸A濃度的增加，Ki67和Livin蛋白表達水平也明顯降低。與對照組比較，作用24、48和72 h，0.5、1.0、5.0和10.0 μmol·L-1靈芝酸A組SUM149細胞Ki67蛋白表達水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，5.0和10.0 μmol·L-1靈芝酸A組24 h及1.0、5.0和10.0 μmol·L-1靈芝酸A組48和72 h Livin蛋白表達水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)。見表4。

表4 各組SUM149細胞中Ki67和Livin蛋白表達水平

Tab.4 Expression levels of Ki67 and Livin proteins in SUM149 cells in various groups

表4 各組SUM149細胞中Ki67和Livin蛋白表達水平

GroupKi67(t/h) 244872Livin244872Control131．2±21．6137．6±24．8138．4±21．3105．4±17．5107．1±16．9109．5±18．4GanodermalucidumA (μmol·L-1) 0．1126．6±20．9124．3±22．7120．3±22．4101．1±16．699．3±11．394．3±10．8 0．5117．3±19．4?109．9±20．1?106．4±20．1?97．9±11．394．7±10．592．1±11．2 1．0112．9±19．2?102．3±19．8?95．4±16．3?92．6±10．586．3±9．6?79．8±9．7? 5．0102．2±17．9?97．9±15．2?83．3±14．9?86．5±10．2?78．9±9．4?74．6±8．2? 10．094．3±15．3?88．5±14．7?75．2±13．0??80．8±9．86?73．5±8．8?65．2±6．4??

*P<0.05 ，**P<0.01 compared with control group.

3 討 論

選擇安全性高、療效好和不良反應少的治療藥物，在炎性乳腺癌治療中具有極其重要的意義，因此也成為目前臨床研究者治療乳腺癌有待攻克的難題。靈芝具有提高機體免疫力、抗腫瘤等多種藥用價值，尤其在抗腫瘤方面的確切機制已引起了醫學研究者的廣泛興趣。研究[9-10]證實：靈芝酸可以激活破壞腫瘤細胞核形成的蛋白酶。作為一種天然的化合物，靈芝酸A已被證實具有抗腫瘤生物活性，對癌細胞具有細胞抑制作用[11]。然而，靈芝酸A抗腫瘤作用機制復雜，目前尚不明確，因此探討靈芝酸A對炎性乳腺癌的作用機制，可為炎性乳腺癌的治療提供新方向，也為臨床上個體化治療提供新方案，具有極其重要的理論和臨床應用價值。

腫瘤的發生是多因素、多基因相互作用的結果，細胞增殖-凋亡的平衡失調是影響其發生發展的重要因素。研究[12-13]表明：凋亡抑制因子的過度表達與腫瘤的發生發展有密切關聯。

Livin屬于凋亡抑制蛋白家族，在多數腫瘤組織中特異性高表達。近年研究[14-15]表明：Livin主要是抑制腫瘤細胞的凋亡，在正常細胞中不表達，而在乳腺癌組織中高表達，且與臨床分期及淋巴轉移有關。本研究結果顯示：Livin在人炎性乳腺癌SUM149細胞質中高表達，表達率隨著靈芝酸A作用濃度增加和作用時間延長而下降，提示靈芝酸A可抑制人炎性乳腺癌SUM149細胞中Livin的表達，推測靈芝酸A下調人炎性乳腺癌SUM149細胞株中Livin的表達是靈芝酸A誘導其凋亡的機制之一。

Ki67是分布于細胞核內的一種非組蛋白性核蛋白，與細胞增殖有密切關聯，表達于G1、S和G2期細胞，被認為是反映腫瘤細胞增殖活性最可靠指標之一[16]。同樣，Ki67在正常細胞中不表達，而在乳腺癌組織中呈特異性高表達，可以反映乳腺癌的生物學行為[17]。本實驗通過細胞免疫組織化學檢測表明：Ki67在人炎性乳腺癌SUM149細胞質中高表達，靈芝酸A可以抑制人炎性乳腺癌SUM149細胞中Ki67的表達，推測靈芝酸A可能是通過下調人炎性乳腺癌SUM149細胞株中Ki67的表達，抑制其增殖。

本研究結果顯示:靈芝酸A能抑制人炎性乳腺癌SUM149細胞的增殖，誘導其發生凋亡，同時還可下調SUM149細胞中Livin和Ki67的表達，表明靈芝酸A下調Livin和Ki67的表達可能是其抑制人炎性乳腺癌SUM149細胞增殖并促進其凋亡的機制之一。

[1] Al-Khanbashi M,Caramuta S,Alajmi AM,et al. Tissue and serum miRNA profile in Locally Advanced Breast cancer (LABC) in response to Neo-Adjuvant Chemotherapy (NAC) treatment [J].PLoS One,2016,11(4):e0152032.

[2] Meng Y,Lin ZM,Ge N,et al.Ursolic acid induces apoptosis of prostate cancer cells via the PI3K/Akt/mTOR pathway[J].Am J Chin Med,2015,43(7):1471-1486.

[3] Sakamoto S,Kohno T,Shimizu K,et al.Detection of ganoderic gcid a in ganodema lingzhi by an indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay [J].Planta Med,2016,82 (8):747-751.

[4] 石 瑋,董 莉,包軍勝.前列腺癌相關分子研究進展[J].中華男科學雜志,2015,21(4):357-362.

[5] Gill BS,Kumar S,Navgeet.evaluating anti-oxidant potential of ganoderic acid a in STAT 3 pathway in prostate cancer [J].Mol Biol Rep,2016,43(12):1411-1422.

[6] Pintha K,Yodkeeree S,Limtrakul P.Proanthocyanidin in red rice inhibits MDA-MB-231 breast cancer cell invasion via the expression control of invasive proteins [J].Biol Pharm Bull,2015,38(4):571-581.

[7] Radwan FF,Hossain A,God JM,et al.Reduction of myeloid-derived suppressor cells and lymphoma growth by a natural triterpenoid [J].J Cell Biochem,2015,116(1):102-114.

[8] Wu M,Wu Y,Lan T,et al.Type Ⅱ cGMP-dependent protein kinase inhibits EGF-induced JAK/ STAT signaling in gastric cancer cells [J].Mol Med Rep,2016,14(2):1849-1856.

[9] 劉 喬.靈芝酸組分提取分離及其體內抗氧化、免疫活性活性作用研究 [D].長春：吉林農業大學,2016．

[10]唐 文.靈芝酸T提高多藥耐藥性腫瘤細胞對阿霉素敏感性的初步研究 [J].天然產物研究與開發,2013,25(8):1052-1055．

[11]周昌艷,唐慶九,楊 焱,等.靈芝中有效成分靈芝酸的抑制腫瘤作用研究 [J].菌物學報,2004,23(2):275-279.

[12]Wang Z,Liu S,Ding K,et al.Silencing livin induces apoptotic and autophagic cell death,increasing chemotherapeutic sensitivity to cisplatin of renal carcinoma cells [J].Tumour Biol,2016,37(11):15133-15143.

[13]Liu AH,He AB,Tong WX,et al.Prognostic significance of livin expression in nasopharyngeal carcinoma after radiotherapy [J].Cancer Radiother,2016,20(5):384-390.

[14]Broodman I,VanDuijn MM,Stingl C,et al.Survivin autoantibodies are not elevated in lung cancer when assayed controlling for specificity and smoking status [J].Cancer Immunol Res,2016,4(2):165-172.

[15]陳建華,范欽和,陳 淼.Livin在乳腺癌中的表達及與c-erbB-2和激素受體的關系 [J].診斷病理學雜志,2008,15(4):320-323.

[16]Huang MH,Poh KK,Tan HC,et al.Therapeutic synergy and complementarity for ischemia/reperfusion injury:β1-adrenergic blockade and phosphodiesterase-3 inhibition [J].Int J Cardiol,2016,214:374-380.

[17]Zhong F,Bi R,Yu B,et al.A comparison of visual assessment and automated digital image analysis of Ki67 labeling index in breast cancer [J].PLoS One,2016,11(2):e0150505.